验证抗氧化剂对镉引起睾丸炎症的预防作用的方法

本发明涉及一种验证抗氧化剂对镉引起睾丸炎症的预防作用的方法。

背景技术：

1、镉(cd)是环境中普遍存在的金属元素，人类可通过工业活动(如采矿和冶炼、电镀、颜料和塑料制造)以及消费品(如使用磷肥、镍电池和吸烟)接触到镉。过度接触这种金属可能对人类健康非常危险。上世纪50年代，日本爆发了一种奇怪的疾病“骨痛”，这就是工业镉污染造成的灾难之一。近几十年来，人们越来越认识到镉的危险，国际癌症协会将这种金属列为人类的a类致癌物，有可能对人类健康造成严重损害。各种研究表明，睾丸是受cd影响最敏感的器官之一。cd对男性生殖系统的慢性影响已得到证实，其中包括睾丸血管和血液-睾丸屏障的结构性损伤，支持细胞和leydig细胞的细胞毒性以及下丘脑-垂体-性腺轴的紊乱。在分子水平上，cd可引起氧化应激相关的损伤，并干扰参与生殖功能调节的基因的选择信号通路和表观遗传调控。除了慢性影响外，急性镉接触还可能影响动物健康和生殖功能，例如，高剂量(6mg/kgbw)cd暴露导致睾丸血红蛋白含量和血清丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶活性在24小时内突然升高。这种治疗还导致睾丸、附睾和附属性器官的重量在2个月内显著降低，同样，单剂量相对较低水平的cd暴露(1mg/kg体重)也会导致退化生殖细胞和多核精子细胞聚集物在7天内大量积累。与长期接触不同的是，很少有研究评估急性镉接触对睾丸生理的影响，特别是leydig细胞功能和睾酮产生的影响。硒(se)是一种矿物质元素，是各种酶和蛋白质的基本成分，称为硒蛋白。硒在体内可以作为天然抗氧化剂，是一种重要的微量元素，能够促进男性生育能力，保护睾丸免受氧化应激引起的损伤。此外，硒酶可以减少炎症对细胞和器官的影响。辅酶q10(coq)的还原形式是线粒体呼吸链中的电子载体，coq可以作为一种抗氧化剂，并已被证明能够预防和逆转由其他毒素引起的睾丸损伤。coq可以通过抑制脂质过氧化、诱导型和内皮型一氧化氮合酶以及生殖细胞特异性凋亡来减轻大鼠睾丸缺血/再灌注损伤。然而，其在cd诱导的睾丸损伤中的作用仍不清楚。环境中重金属镉(cd)的暴露会对男性生殖功能产生不利影响。目前镉暴露对大鼠雄性生殖系统的影响机制存在不清楚的问题，硒(se)和辅酶q10(coq)单独或联合给药存在潜在的挽救作用，目前也不清楚作用机理。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种验证抗氧化剂对镉引起睾丸炎症的预防作用的方法，其步骤简单，可以验证镉暴露通过增加氧化应激和炎症从而对生殖系统造成急性影响，而se+coq可协同防止镉的急性影响。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种验证抗氧化剂对镉引起睾丸炎症的预防作用的方法，包括以下步骤，步骤一，将36只大鼠随机分为6组，每组6只，第一组为对照组，组中大鼠腹腔注射等渗生理盐水，肌肉注射玉米油；第二组中大鼠暴露接受cdcl2，剂量为2.0mg/kg bw，i.p.；第三组在暴露前后12小时分别给予0.3mg/kg bw，i.p.na2seo3和10mg/kg bw，i.m.coq；第四组在cd暴露前后12小时分别给予2.0mg/kg bw，i.p.cdcl2和0.3mg/kgbw，i.p.na2seo3；第五组在cd暴露前后12小时分别注射2.0mg/kg bw，i.p.cdcl2和10mg/kgbw，i.m.coq；第六组在cd暴露前后12小时分别注射2.0mg/kg bw，i.p.cdcl2和0.3mg/kgbw，i.p.na2seo3和10mg/kg bw，i.m.coq；采集各组中大鼠的躯干血250g，离心15min，在4℃下采集血清，-80℃保存；将其中一个睾丸浸泡在液氮中冷冻，并保存在-80℃下；对侧睾丸固定在4％多聚甲醛中进行形态学研究；取肾上腺和脑垂体，-80℃保存；

3、步骤二，采用免疫化学发光法检测血清t，使用2000system kit，用elisa试剂盒检测lh和fsh浓度，t、lh、fsh最低检测浓度分别为0.2ng/ml、0.15ng/ml和0.2miu/ml；

4、步骤三，用trizol试剂盒提取睾丸、垂体和肾上腺总rna，rna浓度用nanodrop nd-1000测定；然后使用promega corporation，madison，usa的反转录系统合成cdna；pcr反应在含有7.5ul 480green i master、0.75ul反向和正向引物、10ul稀释cdna和4ul rnase-free水的23ul混合物中进行；热循环设置如下：pcr反应95℃初始变性5min，95℃变性10s，60℃持续30s，循环40次；

5、步骤四，使用novogene处理组1、2、3和6的rna样本，并进行rna-seq分析；由bioanalyzer 2100评估rna完整性，rin值>7.0；用superscript tm ii逆转录酶逆转录得到cdna片段；测序由illuminanovaseq tm 6000平台完成，用rpackage edgar筛选出p值<0.05的差异表达基因degs，根据基因本体分析、京都基因和基因组数据库和蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示degs功能基团之间的关系和相互作用；

6、步骤五，用ripa裂解缓冲液均质裂解睾丸，获得总蛋白样本，蛋白浓度使用enhanced bcaproteinassay kit进行检测，含有30μg总蛋白的样品在12％的sds-page上分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，在tbst中用5％bsa-v阻断2h后，用一抗在4℃下孵育过夜，然后用hrp偶联二抗孵育1h，采用ecl系统观察，采用image j软件分析蛋白条带密度；

7、步骤六，用4％多聚甲醛固定睾丸，嵌套切片，抗原经高温修复后，过氧化物酶经3％h2 o2孵育15min中和，用10％山羊血清阻断切片，然后用1％山羊血清稀释的scarb1一抗并在4℃孵育过夜，再用相应的结合辣根过氧化物酶的二抗孵育1h，用二氨基联苯胺底物观察抗体结合，用苏木精共染细胞核；使用尼康eclipse 80i在20倍物镜放大下拍摄阳性细胞，阳性细胞的光密度为每个样品选择3个采集区域并进行数据处理，使用image pro plus对结果进行分析；

8、步骤七，cd诱导的氧化应激在睾丸均质化中进行评估，采用检测试剂盒对超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gp x)和丙二醛(mda)进行检测；

9、步骤八，将所有数据用均数±标准差表示，统计采用单因素方差分析。

10、作为本发明的进一步设置，所述步骤三中还包括将所有qpcr结果以核糖体蛋白s16作为内对照进行统一对照。

11、作为本发明的进一步设置，所述步骤五中还包括将数据值调整为β-actin或gapdh作为内对照。

12、作为本发明的进一步设置，所述步骤七中所有样品一式两份。

13、这样设置的有益效果是，采用上述方法，首先，方法给药一剂cd后，大鼠的整体健康和行为没有受到影响，但血清睾酮显著降低。这种效应很可能是直接针对睾丸的，因为垂体lh上调，这是由于低睾酮的反馈抑制减弱。方法详细分析9个类固醇基因/蛋白，发现2个胆固醇相关蛋白scarb1和star有特异性下调。acarb1是一种高密度脂蛋白的细胞膜受体，负责从循环中输入胆固醇，而star是一种对胆固醇穿过线粒体膜的运动有反应的转移蛋白。这两个关键蛋白质的下调可以很好地解释睾酮水平的降低，因为其中一个蛋白质，star抑制了类固醇生成的速率限制步骤。4个支持细胞特异性基因，包括dhh,amh,fshr和sox9，都没有下调，这表明支持细胞可能比leydig细胞更能抵抗cd暴露。方法发现是肾上腺激素原基因的变化，肾上腺是除睾丸外另一个主要的类固醇产生器官，为了检验肾上腺类固醇生成是否也受到cd的影响，方法分析了主要的肾上腺类固醇生成基因acthr,cyp11b1和cyp21a1，以及关键的胆固醇动员基因scarb1和star。与睾丸相反，cd处理后所有5个基因均持续上调，这些增加不太可能是由垂体调节引起的，因为acth的表达没有改变，观察结果有力地表明，肾上腺可能也是急性镉暴露的敏感靶点，但是，肾上腺激素原性细胞与leydig细胞反应不同；原因可能是肾上腺激素分泌主要受外部信号的影响，而睾丸功能主要受内部信号，如营养、生物钟等的调节。因此，像接触镉这样的应激条件可以激活肾上腺功能，同时抑制睾丸功能。

14、方法为了寻找leydig细胞scarb1和star下调的机制，方法用rna-seq技术分析了睾丸细胞的转录组。结果清楚地表明，cd诱导氧化应激和炎症反应。在受cd处理影响最大的10个生物过程中，有8个是ros-或炎症相关，kegg分析检测到的两个最显著的受影响过程是线粒体氧化磷酸化和nadph-氧化酶，这两个主要的ros产生位点。这些变化是cd诱导睾丸氧化应激的机制之一。需要进一步的研究来证实这种可能性。

15、cd除了上调ros相关基因外，还显著提高了多种细胞因子基因及炎症信号通路相关基因的表达，包括mapk、nf-κb和tnfa；westernblots证实了cd对这些信号通路的影响；erk1/2、jnk和p38的磷酸化水平均升高，但总蛋白含量无变化。mapk信号通路的激活可能对star和scarb1的表达有复杂的影响；方法发现，p38 mapk的激活可以抑制star的表达以及cox2的上调，特别是与氧化应激或脂质氧化相关的激活。因此，急性cd暴露下调star和scarb1的机制之一可能与p38 mapk诱导的cox2上调有关；cd抑制star和/或scarb1表达的，或是通过炎性nf-κb信号通路；目前方法中发现nf-κb及其相关细胞因子的cd依赖性增加。结果清楚地表明，镉暴露除了抑制leydig细胞类固醇生成外，还激活了睾丸免疫细胞功能。炎症反应性也与氧化应激机制有关或由氧化应激机制诱导产生，因为使用的两种抗氧化剂完全阻止了nf-κb和相关促炎细胞因子的增加，如il1b、tnfa和与吞噬体和th细胞分化相关的基因。众所周知，促炎细胞因子可以通过下调类固醇生成蛋白来抑制leydig细胞的类固醇生成；因此炎症的是star和scarb1下调的另一个原因。

16、方法中另一个最重要的观察结果是两种抗氧化剂硒和coq对cd影响的交叉预防。这种保护不仅在类固醇生成中被发现，而且在整个转录组的变化中也被检测到。硒是一种传统的抗氧化剂，参与25种硒蛋白的合成，包括gpx,trxr和sepp。此外，硒会影响非酶抗氧化剂和酶抗氧化剂，以建立强大的抗氧化防御。然而，coq在线粒体呼吸链中作为电子载体和氧化磷酸化分子。它会影响与线粒体功能相关的氧化磷酸化。在目前的研究中，方法发现这两种分子单独使用时，在预防急性cd效应方面表现出相对较弱的能力。大多数时候，单独使用这些化学物质并不能有效或有效地保护细胞功能。然而，两者的组合显示出最显著的保护作用，在大多数情况下具有较好的保护作用。这些观察结果发现，两种分子之间存在协同作用，结果清楚地支持这样的结论，即急性镉对睾丸功能的影响是通过氧化应激和炎症介导的，炎症在氧化应激下发挥作用，抗氧化剂可以防止炎症相关信号和细胞因子的增加。此外，方法发现只有两种抗氧化剂的组合才能达到显著的保护作用。方法发现，减少镉暴露可以通过特异性影响胆固醇动员蛋白scarb1和star来抑制大鼠睾丸类固醇生成。急性镉暴露也可能影响肾上腺类固醇生成，但方式与睾丸完全相反。对睾丸和肾上腺的影响与氧化应激有关，但它们都被两种抗氧化剂硒和coq的组合完全阻止。除了氧化应激外，cd处理还激活炎症和相关的nf-κb信号通路和促炎细胞因子。