一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及应用的制作方法

本技术涉及免疫，具体涉及一种针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及其应用。

背景技术：

1、工程化免疫细胞疗法，是一种将免疫细胞加以改造，让它们就能够识别疾病状态并做出适当反应，其中，基因工程t细胞也被称作“活药”，是抗癌领域的最新代表，尤其是嵌合抗原受体t细胞(car-t)，在复发性或难治性血液系统恶性肿瘤治疗过程中具有非常显著的效果。相较于普通t细胞，car-t细胞对于肿瘤细胞的杀伤效果更好，这与car(chimericantigen receptor，简称car,通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)的结构相关。完整的car结构的是由一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,taa)结合区，一个胞外铰链区(hinge area)，一个跨膜区(transmembrane region)和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,itam)。car-t细胞膜表面的car和肿瘤细胞的靶抗原结合后，细胞内序列起到激活car-t细胞活性的作用，car-t分泌穿孔素穿孔素和颗粒酶杀死肿瘤细胞，也可以通过高表达tnf配体，诱导肿瘤细胞凋亡，还能改变肿瘤微环境，进一步增强其抗肿瘤活性。

2、car-t疗法的开发周期较长，关键工序多，其中t细胞的激活扩增步骤至关重要，影响后续t细胞的基因工程改造及治疗效果。目前市场上用于car-t细胞的激活和扩增，没有特异性的产品，常用都是t细胞激活和扩增的产品，比如上述cd3/cd28 t细胞激活磁珠、cd3/cd28抗体等。但这类通用产品对所有的t细胞都起到刺激作用，在慢病毒侵染后的car-t细胞扩增过程中效果不具备特异性，最终导致扩增后起治疗效果的car-t细胞比例不够高，回输到患者体内后，效果不佳。

3、现有技术虽已公开了直接基于肿瘤抗原(游离肿瘤抗原蛋白)或基于其他方式固定的肿瘤抗原对于免疫细胞(尤其是car-t细胞)的激活，比如现有技术中专利文献wo2018111340a1公开了基于存在于固定细胞表面上肿瘤特异性抗原进行特异性刺激car-t细胞，现有专利文献公开cn115397440a公开了基于半抗原标记的细胞刺激嵌合car-t细胞等，然而，现有的这些基于游离肿瘤抗原或细胞表面固定的肿瘤抗原激活免疫细胞的方式存在刺激细胞增殖效率低或操作复杂等问题，实践中仍需突破和改进。有鉴于此，提出本技术。

技术实现思路

0、发明概述

1、针对上述技术问题，本技术通过锐意研究发现，本技术制备的特定结构的磁珠类产品对免疫细胞具有靶点特异性激活和刺激作用，可有效提高免疫细胞在总细胞中的占比。

2、基于此，本技术首要目的在于提供一种特异性针对免疫细胞(尤其car-t细胞)激活和增殖刺激的磁珠类产品，此类产品能够特异性地刺激免疫细胞增殖，提高免疫细胞的阳性率；其次，本技术的其他目的在于制备所述磁珠类产品的方法，以及所述产品在免疫细胞激活和增殖刺激中的应用。

3、本技术的具体技术方案如下：

4、本技术首先提出一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品，包含如下组分：

5、1)肿瘤抗原；

6、2)固体支持物；

7、其中，所述1)肿瘤抗原与2)固体支持物经偶联连接。

8、进一步的，所述肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原；

9、优选的，所述肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原可选自：cd19，psca，claudin，cd123，msln，cd20，cea癌胚抗原，fap，cd133，egfr，egfrviii，bcma，psma，her2，ca125，epha2，c-met，l1cam，vegfr，cs1，ror1，ec，ny-eso-1，muc1，muc16，mesothelin，lewisy，gpc3，gd2，epg，dll3，cd99，5t4，cd22，cd30，cd33，cd138，cd171中的一种；更优选的，所述肿瘤抗原为cd19、bcma或msln。

10、进一步的，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；

11、进一步的，所述固体支持物材质包括但不限于金属、塑料、衍生化的塑料、衍生化的纤维素、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、玻璃或硅等；

12、优选的，所述固体支持物材质为磁性或非磁性材料。

13、进一步的，所述固体支持物的形状包括但不限于：球状或其他形状。

14、进一步的，所述固体支持物的构型包括但不限于：微粒、珠子、试管、微孔滴定板、膜、支架分子滤纸、圆盘、胶乳等。

15、进一步的，所述固体支持物为有磁性或无磁性的固体支持物；优选的，所述固体支持物为为磁珠或微球，其包括但不限于：多聚糖氧化铁微球、peg氧化铁微球或者二氧化硅等医学纳米微球等。

16、进一步的，所述磁珠或微球表面的活性基团包括但不限于：链霉亲和素、羟基、羧基、氨基或甲苯磺酰基等；

17、进一步的，所述磁珠或微球的粒径范围优选在10nm-20um之间。

18、进一步的，所述偶联连接包括但不限于如下任一方式：

19、a、基于生物素与亲和素反应进行偶联；

20、b、基于与his标签结合反应进行偶联；

21、c、基于tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；

22、d、基于抗体结合反应进行偶联；

23、优选的，所述偶联连接的方式是基于a、生物素与亲和素反应进行偶联；

24、更优选的，所述1)肿瘤抗原经生物素标记，所述2)固体支持物经亲和素标记；1)和2)通过生物素与亲和素反应形成偶联物。

25、进一步优选的，所述亲和素为链霉亲和素。

26、根据本技术的一些具体优选方式，上述所述产品是通过生物素化的肿瘤抗原与表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠结合偶联而成。

27、具体的，所述产品示例性包括如下任一：

28、肿瘤抗原-生物素-亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；

29、肿瘤抗原-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；

30、进一步的，所述产品中可进一步包括激活性抗体；所述激活性抗体基于“生物素-亲和素偶联方式”，进一步偶联至上述连接有肿瘤抗原的固体支持物，或单独偶联至独立的固体支持物；

31、优选的，所述激活性抗体为用于免疫细胞激活靶点的抗体；更优选的，所述激活性抗体选自针对：cd3、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd27，cd28，4-1bb，ox40，gitr，cd30，myd88，cd40，icos，baffr，hvem，lfa-1，cd2，cd7，light，nkg2c，slamf7，nkp80，cd160，b7-h3，cd83的抗体中的一种；进一步优选的，所述激活性抗体为针对cd3、cd28和4-1bb的抗体。

32、根据本技术的一些具体优选方式，所述产品还可示例性包括如下任一：

33、激活性抗体-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)；

34、肿瘤抗原和激活性抗体-生物素-链霉亲和素-固体支持物(优选磁珠或微球)。

35、进一步的，所述免疫细胞包括但不限于：t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞等。

36、在一些方式中，所述t淋巴细胞包括工程化的car-t细胞或tcr-t细胞等；

37、优选的，所述car-t细胞包括：自体型car-t细胞和通用型car-t细胞；更优选的，所述car-t细胞为二代、三代或四代car-t细胞。

38、本技术还提供一种装置，所述装置中包含上述任一所述的产品。

39、本技术还提供一种培养体系，所述体系中包括免疫细胞(尤其car-t细胞)和上述任一所述的产品。

40、本技术还提供一种上述产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

41、将肿瘤抗原与固体支持物混合，使肿瘤抗原偶联至固体支持物表面。

42、进一步的，所述偶联方式包括但不限于：通过偶联试剂直接进行偶联，或通过生物素与亲和素反应进行偶联，或通过与his标签结合反应进行偶联；或通过tosyl基团与氨基结合反应进行偶联；或通过抗体结合反应(比如抗fc抗体、抗his标签抗体)进行偶联。

43、优选的，所述偶联是通过生物素与亲和素的结合进行偶联，即通过生物素与亲和素的结合将带有生物素化(生物素标记)的抗原蛋白或抗体(比如肿瘤抗原)偶联在和素磁珠表面；或所述偶联可以是通过co2+与his标签的结合将带有his标签抗原蛋白或抗体偶联至带有co2+的磁珠表面；或所述偶联可以是通过tosyl基团与氨基的结合将抗原蛋白或抗体直接偶联在tosyl基团修饰的磁珠表面；或所述偶联可以是先将抗fc标签的二抗偶联在磁珠表面，再通过带有fc标签的抗原蛋白或抗体与磁珠表面的抗fc段的二抗结合。

44、优选的，所述生物素为链霉亲和素。

45、进一步的，所述肿瘤抗原先进行生物素标记，获得生物素化的肿瘤抗原；所述固体支持物先进行表面链霉亲和素修饰，获得链霉亲和素的超顺磁珠。

46、进一步的，所述生物素化的肿瘤抗原是在重组表达中进行生物素标记；优选的，所述生物素标记是在肿瘤抗原重组表达过程中通过定点生物素化进行生物素标记；更优选的，所述定点生物素化是基于bira酶标记方式进行。

47、在一些具体方式中，所述制备方法具体为：在肿瘤抗原重组表达过程中通过bira酶标记方式定点生物素化进行生物素标记，将生物素化的肿瘤抗原与链霉亲和超顺素磁珠按合适比例混合，室温反应后洗涤磁珠，再加入生物素溶液于室温封闭，封闭后洗涤并重悬磁珠获得产品。

48、在一些更具体方式中，所述肿瘤抗原磁珠是分别使用生物素化的cd19蛋白、生物素化的bcma蛋白或生物素化的msln蛋白与链霉亲和素磁珠(优选表面修饰链霉亲和素的超顺磁珠)偶联后制备的cd19-beads，bcma-beads或msln-beads。具体制备方法为：将生物素化的重组蛋白与sa-beads按合适比例混合后，置于旋转摇床上于室温反应1小时；反应后使用无菌pbs洗涤磁珠3次，加入0.2mg/ml的生物素溶液于室温分别封闭1小时；封闭后使用无菌pbs洗涤磁珠3次，用含0.05％ hsa的无菌pbs重悬磁珠，4℃保存备用。其中，偶联后的磁珠产品的储存液为无菌的pbs或tbs溶液，也可加入一定比例的人血清白蛋白作为保护剂，范围在0.05％-0.5％。

49、进一步的，当所述产品还包括激活性抗体时，所述方法进一步包括基于上述类似的“生物素-亲和素偶联”方式，将激活性抗体进一步偶联至连接有肿瘤抗原的固体支持物上，或单独将激活性抗体偶联至独立的固体支持物。

50、进一步的，本技术还提供上述任一所述的产品在如下方面的任一应用：

51、1)在免疫细胞激活中的应用；

52、2)在免疫细胞扩增中的应用；

53、3)在免疫细胞增殖刺激中的应用；

54、4)在免疫细胞分化中的应用；

55、5)在免疫细胞表面标志物表达上调中的应用；

56、6)在免疫细胞诱导分泌细胞因子或细胞杀伤中的应用；

57、7)在诱导car-t细胞凋亡中的应用；

58、8)在制备针对恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。

59、优选的，所述免疫细胞为car-t细胞。

60、进一步的，所述应用包含在体外培养的步骤，因此某些方面，所述应用可在疾病治疗范畴之外。

61、本技术还提供一种免疫细细胞的体外培养方法，特征在于，将上述任一所述产品与免疫细(比如car-t细胞)进行混合的步骤。

62、本技术的有益技术效果：

63、本技术提供的特定偶联产品能够特异性地刺激免疫细胞(尤其car-t细胞)增殖，同时显著提高免疫细胞阳性率，增加免疫细胞在总细胞中的占比。是采用传统cd3/cd28磁珠方法两倍以上：cd3/cd28磁珠能够刺激t细胞增殖，但是进行car阳性率检测，car-t细胞占比并不高,仅为30％左右；本技术产品也能够有效地刺激t细胞增殖，但是car-t细胞占比明显较cd3/cd28抗体磁珠组高，分别为67％、72％、69％。

64、相比于现有技术中直接基于肿瘤抗原的激活方式，本技术肿瘤抗原和/或激活性抗体偶联在微球或磁珠等载体上，模拟膜表达靶抗原的肿瘤细胞去激活car-t细胞并刺激其增殖的过程。磁珠偶联的靶抗原与car-t细胞膜表面的car结合后，激活car-t细胞,刺激car-t细胞增殖，诱导因子分泌等。偶联肿瘤抗原或激活性抗体的磁珠产品，相较于游离的肿瘤抗原蛋白，刺激car-t细胞增殖效果更好。

65、此外，本技术通过定点生物素化的肿瘤抗原和/或激活性抗体与表面修饰链霉亲和素的磁珠结合，bira酶标记方式定点生物素化方式属于定点标记，其不影响抗原蛋白或抗体本身的结构和生物学活性；抗原蛋白或抗体与磁珠的偶联是通过生物素与链霉亲和素的作用实现，生物素与链霉亲和素之间的亲和力高，结合反应几乎不可逆，获得磁珠产品性质更稳定；磁珠上链霉亲和素与定点标记在抗原蛋白或抗体上的生物素结合后，可形成一个连接磁珠与抗原蛋白或抗体的linker,空间位阻足够大，使得抗原蛋白或抗体在磁珠表面展示更充分，更易于识别car-t膜表面car结构；此外链霉亲和素为四聚体形式，理论上一个链霉亲和素能够结合四个生化素化的抗原蛋白或抗体，起到聚集作用，对此类磁珠产品的生物学活性起到放大作用。