一种可个性化定制的差异化界面“内芯外鞘”神经移植物的制备方法

本发明属于医用生物材料领域，特别涉及一种可个性化定制的差异化界面“内芯外鞘”神经移植物的制备方法。

背景技术：

1、周围神经损伤是急诊与骨科常见病症，原因包括高能量创伤、肿瘤切除术后和慢性系统性疾病等。根据seddon分型标准(按损伤严重程度)，可分为神经失用、轴突断伤和神经断伤。对于较小的损伤，在无较大张力情况下目前临床上多采用“端-端吻合”；而对于严重神经缺损(成年人缺损5mm以上)，自体神经移植仍然是金标准，但这种治疗措施存在供体受限、尺寸失配及供区损害等重要缺陷，且远期随访发现患者治疗后功能恢复十分有限，极大地限制了其临床广泛应用。随着生命科学领域的理论拓展和组织工程技术的进步，神经导管桥接法在临床治疗中的作用被不断提高。各种功能化神经导管通过高效模仿周围神经组织的结构、功能，有望替代自体神经移植，成为临床上治疗首选。

2、目前国内外神经导管市场上不乏一些改进型设计，不仅可桥接神经断端，为周围神经再生提供了一定的力学支撑，还能通过辅助物质交换或添加诱导性生物活性因子，引导轴突向远端延伸，实现周围神经定向再生。然而，这些发明设计主要是从基本的神经适配性、生物相容性和周围神经再生生理方面进行考量，形成的临床产品存在治疗效果不确切和体内降解快等不足。此外，添加生物活性因子存在诱发基因突变、致瘤致畸等风险。相比而言，物理刺激调控效果确切稳定、作用持续且体内应用安全，发挥功能的同时能够避免生物化学制剂的不足，具有更广阔的应用前景。在众多物理干预因素中，通过模仿周围神经的取向性结构对神经移植物赋予拓扑微结构(即仿生理念)广受关注，其中轴向取向微纳结构已被证实具有趋化轴突定向生长的作用，对周围神经长距离缺损意义重大。

3、大量研究工作表明，具有定向微观结构的神经组织工程支架，能够诱导神经细胞的定向排列和生长。目前已报道的仿生型神经导管大多基于单一定向微结构导管结构负载干细胞、神经生长因子等活性物质，模拟天然神经组织微环境。然而，这类神经导管通常只具备轴向单一微通道结构，无法满足特殊形态神经缺损的修复。此外既往神经导管产品或实验研究多采用静电纺丝技术或增材制造来构建中空神经导管，管壁取向排列的纤维可以诱导细胞轴向迁移，纤维表面微纳级沟槽等拓扑结构可以增加细胞在导管内表面的粘附面积，旨在早期建立并维持再生微环境。然而，该结构意味着再生神经外表面将有更多的纤维组织黏附与包裹，在神经修复过程中形成阻碍，甚至引发神经瘤，为神经高质量再生造成困难。因此，缺乏具有内外差异化界面的神经导管使神经难以按需重建，是当前神经修复市场上一个巨大难题。

4、现有技术中已有神经导管(cn202211389588.5一种具有取向微通道的神经移植物及其制备方法；cn202211212723.9一种胶原纤维定向排列的卷轴型神经导管及其制备方法和应用；cn201810660151.8一种多通道周围神经导管及其制备方法；cn201511003594.2一种人工神经支架及其制备方法与应用)。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种可个性化定制的差异化界面“内芯外鞘”神经移植物的制备方法，以克服现有技术中神经移植物缺乏内外差异化界面以及难以实现个性化神经修复的缺陷。

2、本发明提供一种可个性化定制的差异化界面“内芯外鞘”神经移植物的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)基于荧光标记利用三维建模软件构建神经移植物模型，将蔗糖加入生物3d打印机，采用熔融挤出模式3d打印，得到神经移植物糖模板；

4、(2)将聚己内酯pcl和脱细胞基质dnecm溶于溶剂中，搅拌，得到pcl/dnecm混合溶液，将步骤(1)中神经移植物糖模板置于该混合溶液中，多次浸没、取出挥发溶剂，然后在去离子水中浸泡，取出后冷冻干燥，得到pcl/dnecm中空“鞘管”；

5、(3)将脱细胞基质dnecm、丝素蛋白sf和透明质酸ha溶于溶剂中，得到ha/dnecm/sf混合溶液，将步骤(2)中pcl/dnecm中空“鞘管”竖直放置于该混合溶液中，浸泡，预冷，定向冷冻后，通过冷冻干燥或室温融化去除冰晶，得到差异化界面“内芯外鞘”神经移植物。

6、优选地，所述步骤(1)中熔融挤出模式3d打印的工艺参数为：在155-170℃下预加热0.8-1.5h，降温至140-150℃时打印，设定打印针头到底板的高度为1-3mm，交差角度为-15°-+75°，线条间距为0.5-3mm，线高为0.5-1mm，打印针头内径为线高的1.2-2.4倍，打印速度为2-3mm/s，挤料速度为3-5μm/s。

7、优选地，所述步骤(2)中pcl的分子量为60000-90000；pcl和dnecm的质量比为2-6:1。

8、优选地，所述步骤(2)中pcl/dnecm混合溶液浓度为3-10％w/v。

9、优选地，所述步骤(2)中溶剂包括六氟异丙醇hfip。

10、优选地，所述步骤(2)中多次浸没、取出挥发溶剂次数为5-8次。

11、优选地，每次浸没时间为10-15s。

12、优选地，每次溶剂挥发时间不少于5min。

13、优选地，所述步骤(2)中在去离子水中浸泡时间为2-3h，期间每隔30min更换一次去离子水。

14、优选地，所述步骤(3)中dnecm、sf和ha的质量比为1:1.8-2.5:1.8-2.5。

15、优选地，所述步骤(3)中ha/dnecm/sf混合溶液浓度为2 -8％w/v。

16、优选地，所述步骤(3)中溶剂为去离子水。

17、优选地，所述步骤(3)中浸泡和预冷总时间为2-4h。

18、优选地，所述步骤(3)中浸泡温度为2-8℃。

19、优选地，所述步骤(3)中预冷温度为-5-1℃。

20、本发明还提供一种上述制备方法制备得到具有差异化界面“内芯外鞘”神经移植物。

21、本发明还提供一种上述具有差异化界面“内芯外鞘”神经移植物在医用生物材料中的应用。

22、本发明选用蔗糖为打印墨水的原因有二，一是因为蔗糖在熔融状态下流动性、可加工性和成型性良好，二是蔗糖可以快速溶于水中，是良好的牺牲模板。

23、本发明神经移植物“内芯”由生物相容性优异的透明质酸/脱细胞基质/丝素蛋白(ha/dnecm/sf)组成，并沿着由聚己内酯/脱细胞基质(pcl/dnecm)组成的“外鞘”定向轴向排列。通过3d打印技术结合相分离倒模法，个性化定制特殊形状仿生神经导管，用于多分支神经缺损修复。基于荧光标记三维数字建模，蔗糖作为打印原材料，原位加热焦糖化获得打印墨水，3d打印个性化定制所需形状糖模后，浇铸力学强度好且降解相对缓慢的pcl/dnecm等混合溶液于糖模上，通过相分离和模板浸出法制备仿生神经移植物“外鞘”；利用定向冷冻法，使生物相容性好且降解相对较快的丝素蛋白等溶液在“外鞘”内部原位形成轴向取向排列的片层状“内芯填充物”，引导神经细胞髓鞘化和轴突定向生长。“外鞘”材料选择力学性能好且降解相对缓慢的pcl材料，其与取向结构“内芯”不仅能有效防止炎症细胞的侵入，也为神经细胞迁移、轴突延伸提供一条稳定通道，待神经功能恢复过程中逐步降解，避免二次手术。

24、有益效果

25、本发明通过3d打印技术结合相分离倒模法，可实现个性化定制特殊形状仿生型神经移植物，用于多分支神经缺损修复。制备的具有差异化界面“内芯外鞘”结构的神经移植物有效地促进了神经细胞髓鞘化和轴突定向生长，不仅为神经细胞迁移、轴突再生提供一条稳定的通道，而且有效防止炎症细胞的入侵，从而实现受损神经功能的修复。