一种CH25h在治疗H9N2亚型禽流感病毒感染药物中的应用

本发明属于生物医学领域，具体地说是一种ch25h在治疗h9n2亚型禽流感病毒感染药物中的应用。

背景技术：

1、禽流感是由禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)引起的一种世界范围的禽类疫病，每一次严重爆发都会对养禽业造成巨大的经济损失。aiv是单股负链rna病毒，属于正粘病毒科甲型流感病毒。病毒粒子呈典型的球形或杆状、丝状。直径大小为80-120nm。病毒从内到外依次为囊膜蛋白质外壳、核衣壳，粒子表面覆盖有两种纤突，一种为形似棒状的三聚体血凝素(ha)，另一种是四聚体神经氨酸酶(na)，呈蘑菇状。aiv的宿主范围十分广泛，目前已经从大量家禽、野鸟、人、猪、马和貂等哺乳动物身上分离到。野鸟是禽流感的天然宿主，并且在野鸟中不具有高致病性，但野鸟的迁徙会引起禽流感的跨远距离传播，感染其他物种后往往具有高致病性。aiv具有宿主品种适应性，在同一品种的个体间极易扩散，感染传播频率很高，但也偶尔会在相近品种之间发生种间传播，并且在极少数情况下可传播给人类，猪可以同时感染禽流感和人流感，被认为在跨物种传播中过程中起到了关键作用。近年来，也有报道指出，鸡也可以作为流感病毒的混合器，在鸡体内可以组合不同亚型的内部基因与外部基因，从而得到新的亚型流感病毒；

2、胆固醇-25-羟化酶(cholesterol-25-hydroxylase，ch25h)是一种多跨膜内质网相关酶，其主要功能是以o2为附加底物，nadph为辅助因子来催化胆固醇产生25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)，减少胆固醇积累。近期研究发现，ch25h是一种保守的干扰素刺激基因，i型和ⅱ型干扰素与其受体结合后，通过jak-stat信号通路招募转录因子stat1到ch25h基因的启动子近端区域诱导ch25h基因迅速表达。25hc也可通过调节核受体和固醇调节元件结合蛋白的活性抑制胆固醇的生物合成。ch25h具有广谱的抗病毒功能，主要是通过其酶活性产物25hc来发挥抗病毒作用，25hc能够以自分泌和旁分泌的方式调节细胞功能以保护细胞免受病毒感染。过表达ch25h基因或用25hc处理细胞后可通过不同的机制发挥其对囊膜病毒的抗病毒功能；25hc对一些非囊膜病毒的显著抗病毒活性也已经被报道；ch25h也可以通过不依赖其酶活性的方式抑制病毒的复制；

3、胆固醇是细胞膜上丰富的脂质，负责膜的包装和流动性。许多病毒的侵入和出芽释放均受到细胞膜中胆固醇分布的影响，因此在胆固醇生物合成受到抑制时病毒的复制被抑制。ch25h可以催化胆固醇生成25hc，调节胆固醇代谢，并发挥广谱的抗病毒作用。已知控制细胞胆固醇水平的天然免疫反应和稳态途径是相互调节的，早期发现25hc是众所周知的固醇途径的负反馈介质，最新研究发现它可以在多个水平上介导细胞内的抗病毒功能，ch25h及其25hc具有广谱抗病毒活性，对多种囊膜病毒和非囊膜病毒都具有抑制活性，然而对h9n2的影响尚没有报道！

4、综上，因此本发明提供了一种ch25h在治疗h9n2亚型禽流感病毒感染药物中的应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种ch25h在治疗h9n2亚型禽流感病毒感染药物中的应用，以解决现有技术中ch25h可以催化胆固醇生成25hc，调节胆固醇代谢，并发挥广谱的抗病毒作用，已知控制细胞胆固醇水平的天然免疫反应和稳态途径是相互调节的，早期发现25hc是众所周知的固醇途径的负反馈介质，最新研究发现它可以在多个水平上介导细胞内的抗病毒功能，ch25h及其25hc具有广谱抗病毒活性，对多种囊膜病毒和非囊膜病毒都具有抑制活性，然而对h9n2的影响尚没有报道等问题。

2、一种ch25h在治疗h9n2亚型禽流感病毒感染药物中的应用，包括以下步骤：

3、s1、转录组测序分析：转录组测序分析25-羟基胆固醇治疗前后raw264.7细胞基因表达水平的改变；

4、s2、ch25h过表达效果鉴定：进行质粒转染，实时荧光定量pcr(rt-pcr)检测ch25h分子的mrna水平；

5、s3、h9n2病毒感染raw264.7细胞：raw264.7细胞的h9n2病毒感染实验，免疫荧光染色检测h9n2抗原表达，蛋白免疫印迹；

6、s4、h9n2感染raw264.7细胞关键宿主分子筛选：采用raw264.7细胞作为感染模型，通过25-羟基胆固醇作用后利用二代测序平台对各组样本的转录组进行深度测序；

7、s5、ch25h过表达质粒效率检测：针对ch25h目的基因序列，将基因序列克隆至表达质粒载体中，通过体外大肠杆菌扩增后用于细胞转染；

8、s6、ch25h上调后对h9n2病毒感染的影响：转染ch25h分子表达质粒后，观察对病毒感染性的影响。

9、优选的，所述s1中采用核酸抽提试剂盒分别提取对照组、h9n2感染组、25-羟基胆固醇干预组、每组3个独立样本的核酸成分。

10、优选的，所述s1中基于测序结果进行大规模数据分析，分别比较对照组与h9n2感染组，h9n2感染组与25-羟基胆固醇治疗组的基因表达谱差异，通过统计学聚类分析筛选差异显著基因。

11、优选的，所述s2中实时荧光定量pcr/rt-pcr检测ch25h分子的mrna水平是采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的rna提取试剂盒－产品编号：rc112-01提取rna。

12、优选的，所述s2中实时荧光定量pcr/rt-pcr检测ch25h分子的mrna水平是进一步的采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的反转录试剂盒－产品编号：r323-01获取cdna。

13、优选的，所述s3中免疫荧光染色检测h9n2抗原表达是指raw264.7细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达。

14、优选的，所述s4中h9n2感染raw264.7细胞关键宿主分子筛选是基于测序结果进行大规模数据分析，比较h9n2感染组与25－羟基胆固醇干预组的基因表达谱差异。

15、优选的，所述s5中ch25h过表达质粒效率检测是采用体外转染的方法，将ch25h基因的表达质粒转染到raw264.7细胞中去，48h后通过rt-pcr法检测基因的表达效率，通过蛋白印迹法检测蛋白表达效率。

16、优选的，所述s6中随着ch25h基因表达量上升至对照组的8.1倍，对h9n2感染的抑制率达到58.8％，这一结果提示ch25h分子的上调对h9n2的感染具有显著的抑制作用，表明ch25h分子在h9n2感染raw264.7中发挥着重要作用。

17、优选的，所述s6中转染ch25h分子表达质粒后来上调宿主细胞ch25h的表达并感染相同剂量的h9n2病毒，感染48h后采用免疫荧光法检测ch25h分子上调后对h9n2感染的影响，发现与对照组相比，转染ch25h分子表达质粒使ch25h基因上调后，h9n2包膜蛋白抗原阳性的细胞数明显减少，进一步证实ch25h基因的上调能够降低h9n2对raw264.7细胞的感染。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、1、本发明以小鼠单核巨噬细胞raw264.7作为靶细胞，采用转录组测序技术分析25－羟基胆固醇作用后对h9n2感染靶细胞基因表达的影响，从而来寻找可有效抑制h9n2感染小鼠单核巨噬细胞raw264.7宿主因子，从而起到抗感染的功能。本发明通过实验发现ch25h在h9n2感染小鼠单核巨噬细胞raw264.7中发挥着重要的作用，上调ch25h的表达，能明显抑制h9n2的感染。

20、2、本发明筛选到能够抑制h9n2病毒感染raw264.7细胞的一个新的宿主细胞分子ch25h。ch25h基因上调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了h9n2病毒对raw264.7细胞的感染。

21、3、本发明为预防和治疗因h9n2病毒感染所引起的感染提供了新的靶点和治疗方案。