一种蒙脱土上静电吸附载硫化氢的树状多肽纳米凝胶及其制备方法

本发明涉及生物高分子，特别涉及一种蒙脱土上静电吸附载硫化氢的树状多肽纳米凝胶及其制备方法。

背景技术：

1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是一类病原未知的、持续性的消化道炎症性疾患，其中包含溃疡性结肠炎、克罗恩病等。它的症状主要是：腹部疼痛、出血、肠蠕动减弱，而且还可能诱发结肠癌变，对病人的健康乃至生活的质量都造成了巨大的危险，严重危害人类健康及生活质量水平。21世纪炎症性肠病已成为一种全球性疾病，全球总计已有1000多万人受到炎症性肠病(ibd)的影响，并且随着世界经济的发展全球ibd的患病率在不断的攀升。由于ibd的复杂性和极高的发病率，它对患者的日常生活和身体状况都产生了极为恶劣的后果，同时还为世界各地的医疗和社会福利体系增添了沉重的财务压力。

2、结肠炎的发生主要伴随着结肠上皮细胞凋亡、结肠屏障功能受损，从而使肠道中的细菌和内毒素突破肠道屏障进入血管或淋巴系统诱发身体炎症反应，使得免疫细胞在结肠炎症部位大量募集，在受损黏膜部位持续分泌大量的趋化因子、促炎因子和ros，使得粘膜部位一直处于炎症以及氧化应激状态，难以愈合。

3、免疫反应是诱导结肠炎症恶化的重要因素之一。肠道内的黏膜免疫系统包括表达toll受体的肠上皮细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞，它们能够通过对外源性抗原产生免疫反应来维持肠道稳定环境，因此当它们的免疫调节功能出现异常会直接导致肠道屏障的损害和免疫功能紊乱。巨噬细胞在维持肠道免疫环境中发挥了重要的作用，它能够通过调节细胞的凋亡与增值来维持组织环境的动态平衡。巨噬细胞主要分为两种表型：经典活化的m1型巨噬细胞和选择性活化的m2型巨噬细胞。m1型巨噬细胞为促炎细胞，主要是巨噬细胞被细菌脂多糖(lipopolysaccharide,lps)或者促炎因子(tnf-α、il-1β等)诱导而来，m1型巨噬细胞会产生大量促炎因子(tnf-α、il-1β等)对组织产生损伤，使炎症进一步恶化。m2型巨噬细胞为抗炎细胞，会产生大量抗炎因子来缓解炎症反应，促进组织愈合。目前，有研究发现结肠炎症发生期间肠上皮细胞会出现大量凋亡，引发肠道屏障功能缺失，导致巨噬细胞在肠道组织内大量募集，且受肠道内细菌以及毒素的影响使得巨噬细胞向m1型大量转化，使得肠道稳态受到干扰，肠道环境处于炎症环境，其特征有：1)促炎因子的大量分泌，如白介素-1β(il-1β)，白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)；2)基质金属蛋白酶(mmps)浓度上升。mmps在正常结肠环境下表达出低水平，能够切割和重塑细胞外基质，结肠炎症环境下高表达的mmps降解了形成肠道屏障所需的蛋白聚糖、层黏连蛋白以及纤维连接蛋白等，这进一步导致了结肠屏障的损害[13]；3)m1和m2巨噬细胞的极化受到干扰，目前有研究表明，肠道炎症环境下由于肠道免疫功能的紊乱，巨噬细胞被过度炎性激活，导致m1型巨噬细胞占主导地位，肠道环境一直处于促炎状态，巨噬细胞向m2型转化受阻，难以缓解肠道炎症状态。

4、氧化应激也是诱导结肠炎症进一步恶化的重要因素。活性氧(reactive oxygenspecies,ros)是一系列含氧的活泼的化学物质，包括过氧化氢、单线态氧、羟基自由基、超氧阴离子等。正常结肠环境下，活性氧浓度较低，整个环境处于氧化还原平衡状态。目前有研究发现结肠炎症部位存在大量ros积累，有研究表明当肠道组织持续暴露在有害刺激(如致病菌感染，外源性有害物质)下会受到刺激分泌出ros导致炎症反应。同时在炎症期间由于巨噬细胞等免疫细胞在结肠部位的大量聚集和浸润会进一步产生ros，使得肠道部位ros浓度进一步上升，进一步加剧炎症反应，形成炎症级联反应，来使得炎症不断放大且持续，还可通过引起肠上皮细胞凋亡来增加黏膜通透性和损伤肠上皮屏障功能。

5、如何高效抗炎，缓解氧化应激以及修复受损的结肠屏障是在治疗结肠炎中亟待解决的问题。目前临床上主要使用水杨酸盐、类固醇和免疫调节剂等药物来治疗结肠炎，但这些药物都有着各自的不足。

6、1)水杨酸盐：5-氨基水杨酸(5-asa)在ibd的缓解以及治疗方面一直具有关键的作用。对于初期和中期的结肠炎，局部水杨酸盐给药是首选的初始治疗方法，具有很好的治疗效果，同时对于结肠癌有一定的预防效果。但存在长时间给药带来的肾脏毒性以及频繁给药带来的患者依从性的下降的问题。

7、2)类固醇：类固醇对于发展至中期甚至晚期的结肠炎具有比5-asa更好的治疗效果，能够有效的缓解病情。但具有体重增加、血糖障碍和消化性溃疡等严重的副作用，难以长期对患者进行治疗。

8、3)生物制剂：tnf-α抑制剂(ipx、ada)、il-23抑制剂(乌司奴单抗)、jak抑制剂(cp-690)等多种生物制剂已被用于结肠炎症治疗。生物制剂是一种较为安全的药物，副作用低，能够在缓解结肠炎症的同时促进结肠受损黏膜的愈合。但其存在治疗后易复发，再次治疗无效的继发性失败，价格昂贵等缺点。

9、综上所述，目前结肠炎治疗所用的药物普遍存在副作用大，难以长期使用，靶向效果差等缺点，因此，开发更有效安全的ibd治疗药物或策略迫在眉睫。

10、由于h2s良好的抗炎、抗氧化以及保护肠道屏障功能，有望作为一种全新的ibd治疗策略，但其气体特性使得其难以被精准递送和可控释放于病变组织。为此目前已开发出多种h2s的供体分子，但这些供体大都面临可控释放性差，且无法长时间释放h2s等实际问题。比如nahs和na2s在生理环境下极不稳定，遇水则会快速释放大量h2s，进而有引起细胞毒性的风险。jk1和jk2虽然可以在结肠酸性环境下响应释放h2s，但释放速度同样很快，无法实现长效缓释。

11、二烯丙基三硫化物(dats)是从大蒜中分离出的一种油溶性有机硫化物，也是一种独特的h2s供体。相较于其他供体分子，dats具有许多独特优点：1)它只能在生物硫醇(如谷胱甘肽gsh)存在的条件下才会缓慢释放h2s，故释放行为更为可控且具有长效缓释特性；2)1mol的dats理论上可以释放出3mol的h2s，故可以显著减少dats的用量。

12、综上所述，dats在结肠炎治疗方向很有潜力，但由于其水溶性差，开发出一种理想的dats递送系统是必须的。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种蒙脱土上静电吸附载硫化氢的树状多肽纳米凝胶及其制备方法，以解决上述问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一种蒙脱土上静电吸附载硫化氢的树状多肽纳米凝胶，包括树状多肽纳米凝胶载体，树状多肽纳米凝胶以多面体低聚倍半硅氧烷poss为核的三代赖氨酸树状大分子为支化单元poss-lys-g3，并通过交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺)酯dsp化学交联得到的空白纳米胶pdns，还包括：

3、在树状多肽纳米凝胶的网状结构中负载二烯丙基三硫化物dats分子；

4、在树状多肽纳米凝胶的表面包裹蒙脱土mmt。

5、进一步的，蒙脱土mmt通过静电吸附作用包裹在纳米凝胶外围。

6、进一步的，poss-lys-g3和dsp交联的摩尔比为1:8。

7、进一步的，一种蒙脱土上静电吸附载硫化氢的树状多肽纳米凝胶的制备方法，在树状多肽纳米凝胶的网状结构中负载h2s二烯丙基三硫化物dats分子的步骤为：

8、s1、将含有dats的甲醇溶液滴加到含有50mg pdns甲醇溶液中，搅拌均匀后超声处理10min；

9、s2、将甲醇溶液按照1：20的体积比例滴加到去离子水中，室温下以1500r/min剧烈搅拌24h；

10、s3、将反应溶液置于透析袋(1kd)中放入去离子水中透析，离心去除反应溶液中残留的甲醇以及游离的dats；

11、s4、将s3中所得到的溶液通过冷冻干燥得到微黄色棉絮材料dats@pdns。

12、进一步的，在树状多肽纳米凝胶的表面包裹蒙脱土mmt的步骤为：

13、a、首先，在温和搅拌48小时的情况下，将3g mmt粉末添加到100ml水中，以形成mmt和赋形剂的混合物；

14、b、将混合物以5000rpm离心2分钟以除去赋形剂；

15、c、加入50mlnaoh溶液(ph 9-10)以在剧烈搅拌下溶解mmt后使用超声将mmt剥离成为单层结构；

16、d、将所得到的溶液通过冷冻干燥得到白色絮状固体产物；

17、e、将步骤d中的mmt和dats@pdns溶解于去离子水中的到mmt的悬浮液以及dps的纯水溶液；

18、f、将含有mmt的悬浮液滴1mg dats@pdns溶液中，室温条件下剧烈搅拌4h后离心，过滤得到白色固体产物dats@pdns@mmt

19、进一步的，在步骤s1中dats与pdns的投料比为60％。

20、进一步的，在步骤f中dats@pdns与mmt的质量比为1:20。

21、进一步的，dats@pdns@mmt的粒径约为489nm

22、本发明的有益效果为：

23、1、以dats为h2s供体，首先将其可控负载于赖氨酸树状多肽纳米凝胶pdns的三维网络结构中，并进一步静电吸附到mmt表面后构建了一种可特异性覆盖在受损黏膜表面并长效缓释h2s的多功能给药系统dats@pdns@mmt。dats@pdns@mmt粒径约为489nm，电位为-19.2mv,具有良好的稳定性。；

24、2、dats@pdns@mmt具有优异的抗炎性能，能够显著抑制活化巨噬细胞内部炎性因子的表达，并且诱导巨噬细胞向抗炎巨噬细胞极化；

25、3、dats@pdns@mmt具有良好的抗氧化应激性能，可以明显降低活化巨噬细胞内部ros浓度，提高细胞内部ho-1蛋白的表达，进而显著促进结肠表皮细胞的增殖与划痕修复；

26、4、dats@pdns@mmt具有良好的体内抗炎效果，和良好的生物安全性。