一种肿瘤疫苗的制备方法及使用该方法制备的肿瘤疫苗与流程

本发明涉及细胞免疫治疗，特别涉及一种肿瘤疫苗的制备方法及使用该方法制备的肿瘤疫苗。

背景技术：

1、肿瘤细胞具有基因组不稳定性以及体细胞突变快速积累的特征，基因组测序显示，肿瘤细胞具有高度的异质性，在肿瘤病人中可达到成百上千的体细胞突变，突变类型也呈多样化，包括点突变、插入缺失突变、基因扩增、基因重排等。有些突变可造成该基因编码蛋白的变异，突变的蛋白质可导致细胞增殖的失控，从而导致肿瘤发生。

2、癌症疫苗一直是肿瘤治疗领域的研究热点，但是在研究过程中有不少难点，比如抗原的选择、佐剂、传输方式等。个性化新抗原是一系列具有免疫原性的含有肿瘤细胞特异突变的肽段，因此，发现并验证新抗原是一项非常困难的工作，随着dna测序技术以及生物信息技术的发展，让这项工作成为可能。rosenberg等已经证明新抗原特异性t细胞在快速消灭肿瘤及保持患者长期生存起到重要作用，schreiber等证明新抗原的表位展示可为免疫检查点抑制剂治疗提供靶点。直到2017年，两例临床试验的成果发表《自然》杂志上，该成果都采用了新抗原疫苗的治疗方式，研究表明，共有66.7％(4/6)和61.5％(8/13)例黑色素瘤患者在完成切除手术并接受疫苗治疗后，整个随访期间(分别为20-32个月和12-23个月)无复发，因此，个性化新抗原疫苗也成了新的研究热点。

3、个性化新抗原疫苗的筛选及制备过程较为复杂，首先收集患者的肿瘤细胞样品和正常细胞样品，采用外显子测序，通过比对肿瘤和正常细胞的测序数据，分析患者肿瘤细胞中特异的基因突变，包括非同义点突变、插入或缺失突变、基因融合等；通过对患者肿瘤细胞的rna测序，筛选出可转录表达的突变基因；通过人工智能或者机器学习算法，预测这些候选抗原与人类白细胞抗原(hla)的亲和力并进行排序，进一步筛选并决定使用哪些新抗原；新抗原疫苗的制备主要包含多肽合成和rna疫苗，不同的制备方法也将影响免疫原性，制备好的新抗原疫苗注射到患者体内，被抗原呈递细胞(apc)捕获后呈递给cd8+或cd4+t细胞，最终产生抗肿瘤免疫反应。

4、目前有多种类型疫苗，较为普遍的为rna疫苗和多肽，多肽疫苗主要缺点为生成费用高，并且个体化多肽的理化性质具有高度可变性，给生产带来困难。rna疫苗主要缺点为容易发生降解。并且两者对免疫佐剂选择的要求也非常高，这些都限制了应用。

5、因此急需寻找一种具有强大的免疫刺激活性，同时可降低对免疫佐剂的需求的肿瘤抗原疫苗，来解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是针对现有技术中肿瘤疫苗免疫应答水平低，同时对佐剂依赖高的问题，提供了一种肿瘤抗原的制备方法及使用该方法制备的肿瘤抗原。

2、本发明提供的技术方案为：

3、一种肿瘤疫苗的制备方法，将筛选得到的肿瘤抗原的基因序列克隆到病毒表达载体上，制备重组病毒，得到所述肿瘤疫苗；

4、其中，在首个所述肿瘤抗原的基因序列的5’端插入如seq id no.1所示的信号肽序列或与其具有80％以上同源性的序列，在末尾的所述肿瘤抗原的基因序列的3’端插入如seq id no.2所示的mhc转运信号序列或与其具有80％以上同源性的序列；

5、seq id no.1和seq id no.2的具体氨基酸序列如下：

6、seq id no.1：mrvmaprtlilllsgalaltetwags；

7、seq id no.2：ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsys qaassdsaqgsdvslta。

8、所述病毒表达载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒，优选为腺病毒。

9、如果所述肿瘤抗原为1个抗原序列，那么即在其基因序列的5’端插入如seq idno.1所示的信号肽序列或与其具有80％以上同源性的序列，在其基因序列的3’端插入如seq id no.2所示的mhc转运信号序列或与其具有80％以上同源性的序列。

10、本发明利用腺病毒载体表达肿瘤新抗原疫苗，该载体在其它基因治疗领域已经广泛应用，具有很高的安全性，并且还有强大的免疫刺激活性，可降低对免疫佐剂的需求甚至不需要，此外还可编码任意表位的肽段。

11、得到所述重组病毒后可将其利用合适的方式进行治疗。作为优选，在本发明的一个实施方式中，利用制得的重组病毒感染dc细胞的方式进行治疗。

12、可以通过现有技术中任意合适的方法对肿瘤抗原基因进行筛选。例如，全外显子测序结合rna测序和表位预测的方法，lc-ms/ms方法等。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述筛选的方法包括：

13、步骤a)将患者的肿瘤细胞样品和正常细胞样品分别进行外显子组dna测序并比对，找到突变基因；

14、步骤b)对患者的肿瘤细胞样品进行rna测序，确定步骤a)中找到的突变基因是否转录；

15、步骤c)对患者进行hla分型，所述hla分型的类型包括选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-drb1、hla-dqb1、hla-dqa1、hla-dpa1、hla-dpb1或hla-drb5中的一种或几种；

16、步骤d)利用软件和/或数据库，以步骤c)的hla分型结果为参数，分析步骤b)中得到的转录的突变基因是否形成具有免疫原性的特异性抗原基因，找出筛选结果为是的，结束筛选。

17、在本发明的技术方案中，发明人根据患者自身dna突变信息以及rna突变及表达信息，得到可作为疫苗的候选肽段序列，再对患者的hla进行分型，总共分型常见的hla-a、hla-b、hla-c、hla-drb1、hla-dqb1以及非常见的hla-dqa1、hla-dpa1、hla-dpb1、hla-drb5等9种hla，根据hla分型结果，初步筛选得到可被递呈的肽段。扩大hla的分型范围，可以保证最大限度的不漏掉可作为疫苗的候选肽段。

18、在上述步骤d)中，所述的软件和/或数据库可以为任意合适的软件和/或数据库。其用于分析转录的突变基因是否形成具有免疫原性的特异性抗原基因。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述的软件和/或数据库可以为选自netctlpan、netmhcpan 4.0、netmhciipan 3.2或数据库http://www.iedb.org/中的一种或几种。

19、本发明中综合不同软件如：netctlpan、netmhcpan4.0、netmhciipan 3.2或数据库http://www.iedb.org/等预测的结果，可以提高所筛选疫苗的精确度。

20、作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述筛选过程还可以包括：

21、步骤e)在cosmic肿瘤数据库中进一步筛选步骤d)中得到的具有免疫原性的特异性抗原基因是否为驱动基因及热点突变，找出筛选结果为是的，结束筛选。

22、在本发明的技术方案中，发明人利用是否是驱动基因的突变，是否存在于cosmic肿瘤数据库中作为筛选条件，可进一步提高筛选的精确度，并可为疫苗的制备提高效率，以及为患者节省成本。

23、在本发明的一个实施方式中，上述肿瘤新抗原基因的筛选方法可以具体为：

24、1)获取肿瘤患者的肿瘤细胞样品，肿瘤样品可以为穿刺或者手术切除的肿瘤组织，也可以为血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液。

25、2)获取肿瘤患者的正常细胞样品，正常样品可以为血液中的白细胞(白血病和淋巴瘤患者除外)。

26、3)对肿瘤样品和正常样品进行外显子组dna测序，并对肿瘤样品进行rna测序。

27、4)利用bwa软件将肿瘤细胞和正常细胞的dna序列比对到人参考基因组上，再利用gatk4软件通过比对肿瘤和正常细胞的dna序列，分析患者肿瘤细胞中特异的基因突变。此外还需对患者进行hla分型，包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-drb1、hla-dqb1、hla-dqa1、hla-dpa1、hla-dpb1、hla-drb5。

28、5)分析rna测序数据，确定所鉴定的特异基因突变是否转录。

29、6)利用分析软件netctlpan、netmhcpan 4.0、netmhciipan 3.2或数据库http://www.iedb.org/，结合患者的hla分型结果，分析所得到的突变是否可以形成具有免疫原性的特异性抗原，根据评分进行排序，可优选5-50个新抗原。

30、7)根据对发生突变的基因进行是否是驱动基因的，在cosmic肿瘤数据库中是否存在，进一步优选5-20个新抗原。

31、上述肿瘤患者可以为任意合适的肿瘤患者，包括但不限于：肺癌患者、胃癌患者、乳腺癌患者、食管癌患者、肝癌患者、胰腺癌患者、肾癌患者、结直肠癌患者、膀胱癌患者、黑色素瘤患者、卵巢癌患者、宫颈癌患者。

32、利用上述方法可筛选出任意多个肿瘤新抗原基因克隆到病毒表达载体上。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述筛选得到的肿瘤抗原的基因序列编码至少两个肿瘤抗原。更优选地，所述筛选得到的肿瘤抗原的基因序列编码5-20个新抗原。更优选的，所述筛选得到的肿瘤抗原的基因序列编码10个新抗原。肿瘤细胞具有高度的异质性，即肿瘤组织是由多种携带不同突变的肿瘤细胞群体组成，单一针对某一突变不能取得理想的疗效。

33、在筛选出肿瘤新抗原后，就进入克隆步骤，即构建pshuttle-cmv-neo质粒。可以利用本领域常规方法进性。

34、作为优选，所述肿瘤抗原由7-30奇数个氨基酸组成，在所述肿瘤抗原的序列的正中位置的氨基酸存在点突变。外源肽在抗原递呈时将被切割成多肽，mhc-1类分子结合表位肽的长度一般为8-11mer，且以9mer为主，mhcii类分子结合表位肽的长度没有限制，但是通常为13-17mer，且以15mer为主。此外，考虑到dna转录、翻译及病毒包装的效率，外源肽不宜过长，因此，本发明新抗原外源肽的长度为29mer，其中突变的氨基酸为第15个，即处于序列正中位置，可确保新抗原外源肽在抗原递呈切割后能产生足够数量和长度的含有突变氨基酸的新抗原外源肽。作为优选，在所述肿瘤抗原的基因序列的5’端还包括接头序列(linker)，在首个所述肿瘤抗原的基因序列的5’端和信号肽序列之间也包括所述接头序列。

35、更优选地，所述接头序列为ggggs或其变体，优选为gggsg、ggsggggsgg(seq idno.13)或(ggggs)3，更优选为ggsggggsgg(seq id no.14)。

36、作为优选，上述克隆步骤具体为：

37、新抗原(neop)一般为7至30个氨基酸长度，本发明采用29个氨基酸，其中突变的氨基酸为第15个，即处于序列正中位置，为了更有效的激活免疫系统，需要将多个不同的新抗原克隆到表达载体中；为了能使新抗原能有效分泌且定位，在首个新抗原序列5’端加入信号肽(sp)序列mrvmaprtlilllsgalaltetwags；为了确保所有新抗原都能表达并不相互干扰，需要在新抗原序列间加入接头(linker)序列：最为常用的接头为ggggs及其变体，如gggsg，ggsggggsgg，(ggggs)3等，本发明linker序列采用ggsggggsgg；为了提高新抗原表位展示效率，在最末尾的新抗原序列3’端加入mhc转运信号序列(mtp)ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaq gsdvslta。最后通过dna测序验证。具体构建如图1所示。

38、在上述克隆步骤完成后，将pshuttle-cmv-neo转入到含有padeasy的bj5183感受态细胞中，挑单克隆提取重组质粒，用paci单酶切鉴定获得重组腺病毒质粒padeasy-pshuttle-cmv-neo。同时构建空载重组腺病毒质粒padeasy-pshuttle-cmv。

39、提取高纯度padeasy-pshuttle-cmv-neo质粒，用paci酶切线性化，转染hek293细胞，经过两轮病毒扩增后纯化，获得重组腺病毒ad-neo。同时制备空载重组腺病毒ad-vec。

40、本发明制得的疫苗为树突细胞疫苗，可用上述制备的重组病毒通过常规方法制得。包括：单个核细胞的获取、dc细胞的诱导、扩增和培养，以及重组病毒的感染。在体外刺激并扩增负载抗原的dc细胞，可增加抗原提呈效率。

41、本发明的另一个方面，是提供了一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗由上述制备方法制得。

42、作为优选，上述肿瘤疫苗的抗原为seq id no.3～12所示的序列。

43、本发明的有益效果为：

44、本发明利用特定的方法筛选出肿瘤抗原，利用病毒载体，特别是腺病毒载体表达并制备该肿瘤抗原的疫苗，该疫苗具有强大的免疫刺激活性，同时可降低对免疫佐剂的需求。