一种兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分及其制备方法和应用

本发明涉及中药研发领域，具体涉及从医疗机构制剂中开发一种兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分及其制备方法和应用。

背景技术：

1、糖脂代谢性疾病是一类以糖、脂代谢紊乱为特征，由遗传、环境、精神等多种因素参与的疾病，氧化应激和慢性炎症是此类疾病典型的病理特征。贞术调脂方、通脉方、保肾方等主要由佛手、白术、女贞子、大蓟、杜仲、丹参、三七、黄连、黄芪、西洋参、红花、田基黄等药味组成，具有调肝启枢化浊的功效，主要用于防治高脂血症、非酒精脂肪肝、心血管疾病、糖尿病肾病等糖脂代谢性疾病。

2、自由基是机体正常代谢的产物,人体组织中许多生化反应的中间代谢物都伴随有自由基的产生和清除，并且它具有很强的氧化能力。但当人体内自由基产生过多或清除受到限制时，即处于氧化应激状态，抗氧化物质和促氧化物质的平衡失调，则会导致细胞内大分子物质(蛋白质、脂质、糖类)的积累性氧化损伤，加快机体衰老速度，诱发机体产生慢性疾病，危害人体生命健康。另外，在持续高血糖的环境下，蛋白质、脂质或核酸等大分子物质自发地与葡萄糖或其他还原单糖发生非酶促糖基化反应，生成稳定的共价化合物，所形成的不可逆聚合物称晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，ages)。人体内ages的来源可以分为两类，一类是内源性ages，由个体通过新陈代谢或衰老过程产生，另一类则是外源性ages，通过食物即外界进入人体内。他们的形成是正常新陈代谢的一部分，但如果在组织中和体循环中含量过高，就有可能致病。其机理是通过直接修饰蛋白质、脂质、核酸等或者与其受体相互作用的方式诱导氧化应激反应，引起机体各类细胞发生增生、炎症、纤维化反应、形成血栓等，进而加速人体的衰老或导致多种慢性退化型疾病的发生。由于现代生活习惯和环境的变化产生代谢紊乱及代谢产物,包括游离脂肪酸(ffa)和内毒素等极化巨噬细胞并诱发的慢性低度炎症,也称代谢性炎症,后者损伤组织和器官，导致动脉粥样硬化、2型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪肝及肥胖等代谢性疾病的发生并导致代谢性疾病。

3、利用现代分离分析和制剂技术，针对临床确有疗效的医院制剂进行二次开发和转化研究，进而开发疗效好、物质基础明晰的组分中药，是中药现代化研究的重要研究内容之一。本发明基于糖脂代谢性疾病的氧化应激、非酶糖基化修饰和代谢性炎症等核心病理机制，结合抗氧化、抗糖化和抗炎活性的体内外活性评价，从医院制剂贞术调脂方、通脉方或保肾方中分离、纯化和筛选到活性成分，是一种极具潜力的组分中药新药。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供一种兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分，该活性组分具有很好的体外抗氧化、抗糖化和抗炎活性。

2、本发明的另一目的在于提供上述兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分的制备方法，该方法采用制备液相色谱或动态轴向压缩柱色谱分离技术，结合实时在线紫外分光光度检测，对目标活性成分的分离靶向性强，分离纯化工艺紧凑、降低了污染风险环节，重复性好，效率高。

3、本发明是通过以下技术方案实现：

4、一种兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分，按质量百分比，包括如下成分：

5、特女贞苷1-4％、地奥司明0.5-3.5％、新地奥司明0.5-3.5％、迷迭香酸1-4％、橄榄苦苷2-8％、丹酚酸b 7.5-17.5％、蒙花苷17.5％-37.5％、柳穿鱼叶苷1-9％、女贞苷g139.5-29.5％、6’-o-反式-肉桂酰-8-表金吉苷酸1-9％。

6、本发明还提供了上述兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分的制备方法，包括如下步骤：

7、(1)以贞术调脂方、通脉方或保肾方为原料，甲醇超声提取，提取液过滤、浓缩，得甲醇提取液；

8、(2)将甲醇提取液经以c18反相硅胶键合相为填料的制备液相色谱或动态轴向压缩柱层析分离纯化，梯度洗脱，结合实时在线紫外分光光度检测，收集特定时段洗脱流份，浓缩、干燥，即得。

9、优选地，步骤(1)中，所述甲醇超声提取次数为1-2次，提取时间为20-40min，料液比为1:5-10。

10、优选地，步骤(2)中，所述分离纯化的条件为：甲醇为流动相a和含0.1％乙酸的水为流动相b，梯度洗脱，洗脱程序为0～20min，b为5％～40％；20～50min，b为40％～80％；50～60min，b为80％～95％；60～70min，b为95％；70～75min，b为95％～5％；75～80min；b为5％；流速6ml/min；检测波长210nm和254nm。

11、优选地，步骤(2)中，所述干燥为冷冻干燥或真空加热干燥。

12、本发明还提供了上述兼具抗氧化、抗糖化和抗炎作用的活性组分在制备预防或治疗糖脂代谢性疾病的药物中的应用。所述代谢性炎症类疾病包括糖尿病、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、糖尿病心肌病、神经退行性疾病等。

13、本发明通过抗氧化、抗糖化和抗炎活性评价筛选目标分离组分，包括：将各分离组分以相同的浓度在相同的时间内抑制aaph荧光的衰减，评价各组分的氧自由基吸收能力；将各分离组分以相同的浓度在相同的时间内抑制bsa和mgo的糖基化结合，计算对糖基化生成的抑制率；将各分离组分以相同的浓度与环氧合酶2混合，抑制cox-2探针生成荧光，计算对cox-2酶的抑制率。结果表明，上述制备得到的活性成分在浓度为0.05mg/ml时抗氧化orac值4312μmol te/g，对bsa-mgo体系荧光性ages的抑制率为77.78％，对环氧合酶2(cox-2)的抑制率达到84.19％，有很好的体外抗氧化、抗糖化和抗炎活性。

14、本发明进一步通过巨噬细胞抗炎模型来确定目标组分的抗炎作用。在巨噬细胞的培养液中加入目标组分及指定的炎症诱导剂lps，培养结束后确定培养上清液中炎症因子的浓度。结果表明，上述制备得到的活性成分能显著降低lps诱导raw 264.7细胞的炎症因子tnf-α和il-1β的水平。

15、本发明进一步通过动物模型来确定目标组分的体内抗炎活性。具体为：将小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组、f5低、高剂量组。正常组和模型组给予生理盐水，f5组给予用生理盐水配制的f5溶液。给药方式均为腹腔注射，连续给药2天后，除了正常组外，其余各组小鼠均在给药2小时后腹腔注射lps诱导炎症，造模后再治疗给药一天。结果表明，上述制备得到的活性成分对lps诱导的c57/bl6小鼠肝肾损伤具有保护活性。

16、本发明所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂，可以添加药学上适用的辅料或载体，以本领域常规方法制备得到。

17、本发明的有益效果：

18、(1)本发明采用制备色谱或动态轴向压缩柱色谱技术，并通过uv-vis实时检测和流份收集，对目标活性成分的分离靶向性强，分离纯化工艺紧凑、降低了污染风险环节，重复性好，制备效率高；

19、(2)试验研究表明，本发明筛选得到的活性组分具有很好的体外抗氧化、抗糖化和抗炎活性，能显著降低lps诱导raw 264.7细胞的炎症因子tnf-α和il-1β的水平，且对lps诱导的c57/bl6小鼠肝肾损伤具有保护活性，适合应用于制备预防或治疗糖脂代谢性疾病的药物。