一种栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中的应用的制作方法

本发明属于中医药，尤其涉及一种栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中的应用。

背景技术：

1、目前，抑郁症(depression)又称抑郁障碍，以持久明显的心境低落和脑功能障碍为主要临床特征，患者常伴有自杀倾向。世界卫生组织(who)指出，21世纪人类所面对的重大疾病是精神疾病，其中抑郁症普遍爆发的比例将达到15～20％。很多研究都指出抑郁症具有高致残率、高致死率的特点，最新流行病学研究显示，普通人群中抑郁症终生患病率髙达10～15％。抑郁症不仅使患者健康受到损害，生活质量下降，而且给家庭社会造成极大负担，已经成为一个严重的社会和医疗问题。尽管国内外对抑郁症进行了大量的研究，但抑郁症的发病机制尚没有统一定论，现有的治疗药物很难全面的覆盖每种病机学说。目前，大多数研究都集中在单胺类神经递质的含量问题，临床治疗药物也多以此为靶点，但以5羟色胺再摄取抑制剂为代表的药物并不能对所有患者产生作用，而且副作用较大，患者的依从性不佳。

2、中医学对抑郁症的认识较早，在《内经》时期，就记载了“五脏化五气，喜怒悲忧恐”、“情志致郁”的论述。从古至今，中医学对抑郁症的防治积累了丰富的经验。特别是典籍中的经方和验方，是基于大量的临床实践总结出的有效药物。这些方药大都有着较为可信的临床疗效，有着很高的传承及创新价值。中药复方中化学成分较多，作用的靶点和通路复杂，如何利用现代科学技术，去挖掘药物作用的分子机制是重要的科学问题，有助于发现新的治疗靶点和标志物，为临床开发新的药物提供更为广阔的思路。

3、抑郁症的发病机制与遗传、心理、社会环境、生物因素等相关，近年来研究氧化应激和抑郁症的联系逐渐增多，表明氧化应激可能是此类疾病的发病机制之一。人体脑部耗氧量高，抗氧化能力弱，容易出现氧化应激损伤，破坏神经元结构。氧化应激还可以诱导炎症因子的产生，介导炎症损伤。oertel等人关于精神分裂症和神经退行性疾病的研究中发现，氧化应激和慢性炎症等病理生理特征在疾病中发挥着重要作用，在可卡因引发焦虑和抑郁行为的研究中发现，敲低mir-134通过抑制炎症反应和细胞凋亡，以及改善氧化应激状态可缓解焦虑和抑郁行为。kandola的研究也证实了，在生物学方面，治疗和预防抑郁症是通过改善氧化应激、炎症反应以及内分泌系统等方面进行调控的。氧化应激的发生是自由基产生增多、脂质过氧化所导致的，由此产生的炎性反应可以进一步诱导神经细胞凋亡，参与抑郁症的病理过程。

4、中医学典籍并无“抑郁症”的病名记载。观其发病的症状和特点可归于“郁证”范畴。此证多因情志不舒起病，以气机不畅为基本病机。郁证病程较长，初在气分，久则夹痰、夹瘀，出现气郁化火或痰瘀化火；再久则耗伤气血津液，虚火内生。可见郁而化火，火热上扰贯穿着郁证发生发展的始末。郭蓉娟等推演了情志病中西医病机的演变过程：在神经-内分泌调控不能负荷应激时，激活的免疫系统使机体处于慢性炎症的病理状态，而这一过程与中医学气郁-久郁化火的过程相契合，并提出了“火郁”为慢性微炎症状态，是情志病的重要病理基础。栀子豉汤(zzct)出自《伤寒论》，是清热除烦，宣发郁热的代表方，也是临床中治疗抑郁症的常用药对及药方。方中应用栀子配伍淡豆豉，借轻清宣发郁热之功，清解无形邪热郁结之证，是对“火郁发之”最好的诠释。根据网络药理学研究，栀子豉汤中抗抑郁作用主要来自于栀子的活性成份环烯醚萜类化合物。其他治疗郁证-气郁化火的代表方丹栀逍遥散，或通治六郁之证的越鞠丸，都是在宣畅气机的基础上，配伍栀子清热泻火。而栀子豉汤多靶点多层次的抗抑郁机制也被广泛认可。但无论是单体栀子苷或是栀子豉汤，其调控氧化应激和炎症反应的具体作用机制仍不清楚，有待进一步研究。

5、lncrna(long non-coding rna)是ncrna家族中最大的一类，长度从200nt到数千不等，可形成更复杂的空间结构与多个蛋白质分子结合，故携带的信息量更为丰富，可通过多种途径如调节组蛋白和dna的化学修饰参与基因表达的各个阶段。中枢神经系统含有丰富的lncrna，且在不同脑区和不同细胞类型的表达不同，并且参与调控神经干细胞分化及功能保持、神经细胞凋亡等过程。lncrna已被广泛证明与精神疾病(如神经精神疾病(npd))相关，包括自闭症谱系障碍(asd)，精神分裂症(sz)，智障(id)，重度抑郁症(mdd)，rett综合征(md rett)等，常被视作研究脑部疾病分子机制新的切入点。目前lncrna在抑郁症发病机制领域仅有少量初步研究，在seki的研究中，测量了29名重度抑郁症(mdd)患者和29名年龄和性别匹配的健康对照者外周血白细胞中83个lncrnas的表达水平，发现lncrnarmrp的表达水平较低，其表达水平与抑郁严重程度相关。与此同时，lncrna可能介导了阿尔茨海默病、精神分裂症及帕金森病的神经认知和情感功能异常的病理过程。抑郁症也被证实是一种神经认知异常的疾病，因此，推测lncrna可能在抑郁症疾病中也存在差异性表达，并且在抑郁症发生发展过程中发挥重要作用。

6、心理应激引起的情绪异常会对脑的结构和功能产生负面影响，脑内神经元的生长、发育、再生涉及多个信号转导级联反应。脑源性神经生长因子(bdnf)是神经营养因子家族的重要一员，广泛分布在中枢和周围神经系统，尤其在海马和大脑皮层含量最高。它对中枢神经系统多种类型神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复都具有重要作用，也是与抑郁症、精神分裂症、强迫症、阿尔茨海默症等神经精神疾病相关的上游因素。

7、bdnf被确定为许多神经疾病的有效神经保护和神经再生剂，nano-bdnf在小鼠大脑中可缓解脂多糖诱导的炎症，从而具有良好的神经保护作用。在慢性术后疼痛(cpsp)导致抑郁症的研究中发现，氯胺酮通过提高bdnf水平，减少大鼠海马中的促炎细胞因子，抑制氧化应激，从而缓解cpsp大鼠的抑郁情绪。而且在抑郁小鼠中，肝水解产物(lh)可以通过增强海马组织中磷酸-ampk，脑源性神经营养因子(bdnf)和磷酸环-磷酸腺苷反应元件结合蛋白(creb)蛋白进而改善小鼠抑郁样行为。

8、那么，six3os1是如何调控bdnf表达水平的呢？有研究发现幼年经历丰富的小鼠bdnf启动子ⅲ和ⅳ区域h3k4甲基化修饰上调，生活单调的小鼠则相反；同样的，在幼年与母亲分离的幼犬bdnf启动子区域h3k4甲基化修饰下调；redlich的研究也发现bdnf的表观遗传学修饰与精神疾病和相关脑功能有关，其中bdnf高甲基化修饰可能降低bdnf mrna表达并上调杏仁核反应性。这些研究结果提示：bdnf的组蛋白甲基化修饰促进了转录和表达，并与抑郁症的发生过程有密切关系。

9、bdnf可以抑制氧化应激和炎症反应，在神经保护机制的研究中发现，在氧化应激诱导的神经毒性中，激活trkb/creb/bdnf能够发挥抗氧化和抗凋亡的功能，在caviedes的研究中发现在抑郁症中bdnf和nf-kb信号通路之间存在反向调控作用，调控神经发生和突触传递机制，而nf-kb信号通路在抑郁症氧化应激中发挥着重要的调控作用，在番红花对lps(细菌脂多糖)诱发的焦虑和抑郁样行为的抗炎机制研究中发现，番红花可以通过抑制包括nf-kb在内的因子活性，抑制lps诱导的bv-2小胶质细胞中no，tnf-α，il-1β和ros的产生。且在栀子豉汤处理抑郁症小鼠中发现，bdnf表达上调，因此，推测以栀子苷为主要抗抑郁成份的栀子豉汤，可以通过six3os1招募kmt2a上调bdnf的表达水平，抑制氧化应激和炎症反应，达到治疗抑郁症目的。

10、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

11、(1)抑郁症的发病机制尚没有统一定论，现有的抑郁症治疗药物很难全面的覆盖每种病机学说。

12、(2)现有临床治疗药物多以单胺类神经递质为靶点，但以5羟色胺再摄取抑制剂为代表的药物并不能对所有患者产生作用，而且副作用较大。

13、(3)无论是单体栀子苷或是栀子豉汤，其调控氧化应激和炎症反应的具体作用机制仍不清楚，有待进一步分析。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中的应用。

2、本发明是这样实现的，一种栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中的应用，栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中应用，栀子豉汤通过上调lncrnasix3os1分子，启动一系列变化。

3、进一步，治疗抑郁症药物成分包括栀子豉汤或衍生物以及制药学上可接受的辅助成分。

4、进一步，治疗抑郁症药物剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液、悬浮液或注射液中的任意一种。

5、进一步，栀子豉汤通过上调lncrnasix3os1，使lncrnasix3os1招募组蛋白h3k4甲基化转移酶kmt2a到bdnf启动子区域，参与bdnf组蛋白甲基化并促进表达，起到抗氧化应激和抗炎症作用，从而达到治疗抑郁症的目的。

6、本发明的另一目的在于提供一种鉴定栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中应用的方法，鉴定栀子豉汤在制备治疗抑郁症药物中应用的方法包括以下步骤：

7、步骤一，分析栀子豉汤对cums模型小鼠动物行为学和组织形态学变化；

8、步骤二，确定栀子豉汤通过上调six3os1减轻抑郁小鼠神经元氧化应激和炎症反应的分子机制；

9、步骤三，确定six3os1招募kmt2a介导bdnf组蛋白甲基化机制；

10、步骤四，分析six3os1介导bdnf甲基化减轻抑郁小鼠神经元氧化应激的分子机制；

11、步骤五，体内验证栀子豉汤通过上调six3os1介导bdnf甲基化对抑郁症小鼠模型的影响。

12、进一步，步骤一中的分析栀子豉汤对cums模型小鼠的动物行为学和组织形态学变化包括：构建慢性不可预知性温和刺激抑郁模型小鼠，用高中低不同剂量浓度栀子豉汤灌服模型小鼠；分别进行糖水偏好试验、尾部悬挂试验、旷场试验、强迫游泳试验和水迷宫的行为学试验；通过he染色、nissl染色和tunel染色观察神经元损伤情况。

13、进一步，步骤二中的确定栀子豉汤通过上调six3os1减轻抑郁小鼠神经元氧化应激和炎症反应的分子机制包括：根据测序结果，筛选出lncrnasix3os1；进行体外原代神经元培养，qrt-pcr检测各组组织和细胞中six3os1的表达水平；在神经元细胞中过表达/抑制six3os1；检测各组细胞tnf-α、il-1β、il-6，sod、gsh、cat和mad的表达情况，利用westernblot检测bax和cleaved-caspase3水平，观察氧化应激、炎症反应及神经元凋亡情况。

14、进一步，步骤三中的确定six3os1招募kmt2a介导bdnf组蛋白甲基化机制包括：利用fish实验检测six3os1在神经元细胞中的定位情况；利用rna pull-down实验观察six3os1和kmt2a的结合关系，进行rip实验验证；利用chip实验检测kmt2a和bdnf基因的结合情况，以及six3os1对kmt2a和bdnf基因结合的影响；干扰six3os1、kmt2a，westernblot检测对bdnf表达以及h3k4甲基化修饰水平的影响；在cums-cell组和cums+zzct-cell组细胞中沉默kmt2a，检测bdnf的表达水平。

15、进一步，步骤四中的确定six3os1介导bdnf甲基化减轻抑郁小鼠神经元氧化应激的分子机制包括：通过数据库分析预测，lncrnasix3os1的下游靶蛋白为bdnf，根据基因芯片筛选并证实bdnf在抑郁症中低表达，通过rt-pcr检测下游蛋白bdnf的表达情况；在cums-cell组和cums+zzct-cell组细胞中过表达/抑制six3os1，检测bdnf的表达情况；转染沉默bdnf质粒进行rescue实验；利用在线分析软件，对bdnf启动子区cpg岛的分布进行分析，并用重亚硫酸盐测序检测bdnf启动子区甲基化，染色质免疫沉淀分析bdnf启动子各个调控因子组蛋白甲基化水平的变化；检测各组细胞sod、gsh、cat和mad的表达情况，观察神经元损伤情况，利用western blot检测bax和cleaved-caspase3水平，观察神经元凋亡情况。

16、进一步，步骤五中的体内验证栀子豉汤通过上调six3os1介导bdnf甲基化对抑郁症小鼠的影响包括：将sh-nc、sh-six3os1、oe-nc、oe-six3os1腺病毒注入cums组和cums+zzct组小鼠海马区，检测小鼠各项指标变化，qrt-pcr检测腺病毒的效率，检测six3os1、kmt2a和bdnf的表达情况；行为学观察各组小鼠的抑郁行为；elisa检测各组细胞il-1β、il-6、tnf-α、sod、gsh、cat和mad的表达情况，western blot检测bax和cleaved-caspase3水平。

17、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

18、第一、本发明人前期对栀子做了大量的分析，发现栀子中含量最高的药物成份栀子苷(geniposide，gp)，对抑郁模型小鼠的动物行为学有明显的改善作用，并且能够降低小鼠血清中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的表达，使抗氧化物质sod、gsh和cat显著增加，具有抗氧化应激及抗炎症的作用。本发明将前期药理学分析回归于中医理论，深入探讨栀子豉汤原则治疗抑郁症的分子机制。

19、为了进一步分析lncrna在抑郁症中所扮演的角色，发明人对栀子苷干预小鼠进行了转录组基因测序，通过去低质量序列、去接头污染等一系列数据处理得到clean reads。将clean reads与小鼠基因组进行比对，差异分析获得了55个差异表达基因。在这些差异基因中，发现lncrnasix3os1在栀子苷治疗组中的表达量显著上调。进一步qrt-pcr检测体内小鼠模型和体外神经元中six3os1表达水平，发现与cums模型组相比，经栀子苷干预后的小鼠six3os1表达水平显著增加；与cums-cell相比，cums+gp-cell six3os1表达显著增加(p<0.05)。并且本发明发现，过表达six3os1可以下调氧化应激水平，敲低则相反。本发明的结果表明，栀子苷可以上调six3os1表达，并抑制氧化应激反应，对抑郁症有治疗作用。在本发明的预实验中，用栀子豉汤干预cums模型小鼠后，qrt-pcr检测小鼠模型脑组织，同样发现six3os1表达水平显著增加，至于其抗氧化应激及炎症，并治疗抑郁症的分子机制仍有待阐明。

20、bdnf发挥作用的机制在神经疾病领域是一个重要的分析热点，本发明人通过基因芯片筛选和前期预实验证明，在抑郁小鼠模型中bdnf显著低表达，同时过表达six3os1能够增加bdnf的表达水平，说明在抑郁模型中six3os1能够调控bdnf的表达。进一步深入的分析和调研中，本发明人发现bdnf能够发生组蛋白甲基化修饰，组蛋白h3k4的甲基化与基因转录激活有关，而kmt2a基因则是组蛋白h3k4甲基化转移酶。但是在本发明中，six3os1是如何调控bdnf表观遗传修饰，又是如何调控氧化应激和炎症反应，从而影响抑郁症的发生过程，需要进一步分析。为了解决这一科学问题，本发明人在预实验生信分析中发现bdnf启动子区域存在大量cpg岛，six3os1分别与bdnf启动子以及h3k4甲基化转移酶kmt2a之间存在靶向结合关系，说明six3os1可能通过招募h3k4甲基化转移酶kmt2a到bdnf启动子区域，参与bdnf的组蛋白甲基化修饰，促进其表达。

21、综上所述，在前期分析和预实验的基础上，本发明合理提出假说：栀子豉汤通过上调lncrnasix3os1，使lncrnasix3os1招募组蛋白h3k4甲基化转移酶kmt2a到bdnf启动子区域，参与bdnf组蛋白甲基化，促进其表达，起到抗氧化应激和抗炎症作用，从而达到治疗抑郁症的目的。

22、第二、本发明明确栀子豉汤可通过抗氧化应激反应和抗炎症反应改善抑郁模型小鼠的动物行为学作用；明确lncrnasix3os1招募kmt2a介导bdnf组蛋白甲基化参与抑郁症发生发展的分子机制；体内体外双向验证栀子豉汤通过上调lncrnasix3os1的表达水平，从而使其招募kmt2a介导bdnf组蛋白甲基化治疗抑郁症的科学假说；分析lncrnasix3os1是否可作为治疗抑郁症的有效靶点，以及解释应用栀子豉汤治疗抑郁症的分子生物学机制。

23、本发明从临床实践出发，以栀子豉汤的网络药理学分析为起点，以主要中药单体栀子苷进行转录组学高通量测序，筛选差异明显的调控基因，找到其调控改善抑郁症的信号轴，执简驭繁，而后再还原到中药复方栀子豉汤中去验证，寻找治疗抑郁症的有效靶点。本发明从转录组学高通量测序入手，使筛选出的作用靶点更加可靠，在一条调控信号轴上作深入分析。从抗氧化应激、抗炎的角度将lncrna的调控作用与功能蛋白的组蛋白甲基化修饰联系起来，丰富了中药汤剂的治疗靶点，拓展了分析分子机制的方向。

24、本发明人分析抑郁症多年，尝试过不同的抑郁模型复制方法，本发明中采用的cums模型，结合了孤养法，应激方法是经过前期积累重新设计的，包括造模的总时间、每种应激手段的操作和应激时间，具有一定的创新性。本发明聚焦于分析栀子豉汤治疗抑郁症的分子机制，以网络药理学和转录组基因测序技术为基础，探索有效的作用靶点，提高临床应用此方药治疗抑郁症的反应率和精准度，为推动成果应用向中医药产业发展、转化提供理论支撑。