一种采用多参数流式细胞术检测外周血免疫细胞的方法与流程

本发明涉及检测方法，特别是一种采用多参数流式细胞术检测外周血免疫细胞的方法。

背景技术：

1、肺癌是中国发病率第二的肿瘤，对于肺癌的有效治疗直接关乎着病人的生存时间。免疫检查点抑制剂引发了非小细胞肺癌治疗格局的革命，对比传统化疗来说，其降低了肺癌患者60％的死亡风险，但是现实情况却是，只有20％的患者表现出对药物有反应，并且缺乏有效的生物标志物来识别治疗响应者。为了精准用药，减少患者和职能部门的医药费用支出，临床上迫切需要准确、简便的生物标志物识别出对药物有反应的患者。

2、目前，医学界在临床试验和转化研究中探索了多种类型的生物标志物的预测价值，包括免疫相关的生物标记物和肿瘤相关的生物标记物。免疫相关的生物标志物，包括程序性死亡受体1(programmedcelldeath1ligand 1，pd-l1)、肿瘤浸润淋巴细胞、基于转录组的组合免疫特征模型和微生物组等。pd-l1表达是最被学界认可的生物标志物之一，其预测作用得到了肿瘤iii期临床研究的支持，并且已被临床指南批准作为免疫治疗的伴随诊断。尽管如此，一些pd-l1低表达患者在免疫治疗有临床获益，而一些高表达pd-l1的患者对免疫治疗无反应，这表明了pd-l1表达预测疗效还不够准确。肿瘤浸润淋巴细胞在组织的浸润与更多的临床获益相关，该生物标志物还没有得到广泛认可，其局限性在于只考虑了肿瘤浸润淋巴细胞，但其往往具有双向性，同一种细胞可以表现出抑制表型，也能表现出促炎表型，因此该指标只考虑了数量而忽略了其功能。免疫特征模型显示了很好的预测效果，但其局限性是基于rna测序数据，而在生物体中真正实施功能的是蛋白质，该模型需要在蛋白质水平上进一步验证。肿瘤突变负荷(tumormutationburden，tmb)作为肿瘤相关的生物标志物，其预测价值具有一定争议性；一方面，一些转化研究和汇总分析报告了它与临床结局相关，另一方面，在大型iii期临床试验中观察到tmb和临床疗效无关，这给tmb的疗效预测作用蒙上了一层阴影。总体而言，上述所有标志物都是基于人体活检组织实现的，具有一定侵入性，创伤大，机体免疫状态处于一定的变化中，组织活检也不便于连续监控，制约着这些生物标志物的应用。

技术实现思路

1、为了克服现有生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗效中，由于技术所限，存在预测效能不够高，忽略免疫细胞功能因素，rna数据需要进一步验证，基于组织活检创伤大，不便于连续监控等局限性的弊端，本发明提供了充分结合现有生物标志物的优势经验，也考虑到现有生物标志物的局限性，纳入多个功能标记蛋白和免疫细胞分群标记蛋白，利用机器学习的方法获得多参数免疫预测模型，经过相关步骤获得的免疫预测模型，一方面基于外周血，创伤小、能够多次检测监控，另一方面通过联合细胞功能和数量，使得模型的预测准确性达到了89％，且基于蛋白质表达，更具有可信度，为有效验证生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗效起到了有利技术支持的一种采用多参数流式细胞术检测外周血免疫细胞的方法。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种采用多参数流式细胞术检测外周血免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤a：外周血采集，具体的，登记入组患者的临床信息，收集患者免疫治疗前的外周血；步骤b：外周血单个核细胞分离和冻存，具体包括如下流程，(1)将外周血样品用溶液稀释混匀，(2)加入淋巴细胞分离液并离心，(3)将单个核细胞层用吸出并离心去除上清，(4)加入红细胞裂解液重悬细胞，(5)加入pbs溶液终止裂红并离心去除上清，(6)加入细胞冻存液吹打混匀后冻存；步骤c：解冻和细胞计数，具体包括如下流程，(1)将步骤b中冻存的细胞预热解冻，(2)加pbs溶液混匀并离心、去除上清；(3)加pbs溶液重悬细胞并加入台盼蓝混匀后计数；步骤d：多色流式细胞术，具体包括如下流程，(1)取外周血单个核细胞放入ep管溶液洗涤，(2)细胞用工作溶液吹打混匀并敷育，(3)加入封闭液混匀并孵育，(4)加入含有特异性表面标记荧光抗体的cocktail、振荡离心混匀并敷育，再加入剩余的其他荧光抗体cocktail，(5)振荡离心混匀并敷育、溶液洗涤离心并去上清，(6)加入溶液重悬并过滤后转移至流式管、在bd facsymphonytm机器上机检测；步骤e：数据分析和模型训练，使用r包分析流式机器的fcs格式文件、并对细胞分群进行注释，具体包括如下流程，(1)t细胞分类，(2)根据每个类群中标志基因表达的热图手动进行亚型注释，最终经umap降维方法分析得到分群结果，(3)构建区分疗效的分类模型，涉及到的数据处理、使用治疗前的样本标志物表达数据，分类模型中使用kknn r包中的函数kknn进行模型构建、获得疗效预测模型，为了评估该模型的预测准确性，采用交叉验证的方法最终获得的平均auc曲线下准确率数据。

4、进一步地，所述步骤a中，收集的是患者在免疫治疗前，用药一周期时的外周血。

5、进一步地，所述步骤b，(1)中溶液是4ml无菌pbs溶液稀释；(2)中加入淋巴细胞分离液量是4ml、离心时间20min；(3)中加入的是pbs溶液混匀，离心时间是10min；(4)中，加入的红细胞裂解液量是3-5ml，吹打混匀后，室温放置10min；(5)中加入的溶液是pbs溶液，离心时间是5min；(6)中加入的细胞冻存液量是1ml。

6、进一步地，所述步骤c，(1)中预热解冻温度是37℃；(2)中加入的是pbs溶液、离心是10min；(3)中加入的溶液是1ml pbs，加入台盼蓝是10μl。

7、进一步地，所述步骤d，(1)中外周血单个核细胞数量是4x105个，pbs溶液两次，离心时间是5min；(2)中工作溶液是30μl zombie，敷育时间是15min；(3)中，加入的封闭液是30μl，孵育时间是15min；(4)中加入的荧光抗体是ccr系列及cxcr3；(5)敷育时间是20min、溶液是pbs溶液、离心时间是5min；(6)中，溶液是300μlpbs，经200目尼龙网过滤后再转移至流式管。

8、进一步地，所述步骤e，(1)中t细胞分类分别是cd4-cd8双阴性细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞和固有样t淋巴细胞；(3)中，构建区分疗效的分类模型、总共确定了611个组合特征，这些特征包含了所有单独的标志物在样本中的平均表达，细胞类型和标志物蛋白在样本中的联合表达，以及标志物蛋白在所有样本中表达量的偏差和标准差；涉及到的数据处理中、第一步进行数据标准化、然后使用log1p对其进行自然数-log转换，最终确定了9个具有组间显著差异的组合特征；分类模型中，随机选取70％的样本数据作为训练集，剩余30％的数据作为测试集。

9、本发明有益效果是：本发明在相关步骤共同作用下，基于外周血29色流式细胞术和机器学习，经过5个步骤获得多参数免疫预测模型，能够预测免疫治疗患者的疗效，具体的，一方面基于外周血作为样本，创伤小、能够多次检测监控，另一方面通过联合细胞功能和数量，使得模型的预测准确性达到了89％，此外，本发明基于蛋白质表达，更具有可信度。本发明克服了现有生物标志物中，预测效能不够高，忽略免疫细胞功能因素，rna数据需要进一步验证，基于组织活检创伤大，不便于连续监控等局限性，为有效验证生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗效起到了有利技术支持。基于上述，本发明具有好的应用前景。