水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用与流程

本技术涉及生物医药，具体涉及水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、由于创伤、感染及肿瘤等引发的骨骼疾病易导致骨缺损，将严重影响患者的生活质量，如骨缺损超过一定范围，超过了骨骼的最大自行修复能力，则该骨缺损部位将无法自行愈合，从而导致无连续性骨痂形成，造成骨不连。针对这种情况，目前临床上主要采用自体骨移植或同种异体骨移植的方法进行治疗。但自体骨移植来源有限，而同种异体骨移植则面临免疫排斥等并发症问题，限制了其在临床的广泛应用。随着骨组织工程学的发展，利用生物材料、种子细胞和生长因子为新的骨组织再生提供场地，为骨缺损的治疗开辟了新的途径。

2、由于骨缺损部位血管遭受严重破坏，导致局部血供严重不足，造成缺氧及营养耗竭等恶劣微环境，严重影响骨修复过程中种子细胞发挥作用。骨髓间充质干细胞是主要的骨修复种子细胞之一，研究证实，缺氧会下调关键成骨转录因子runx2，抑制其成骨分化，并且当氧浓度在2％以上骨髓间充质干细胞才会发生成骨分化。

3、当骨缺损发生时，局部活性氧水平明显升高，导致种子细胞发生氧化应激，导致细胞处于氧化应激状态，直接激活bmscs中叉形头转录因子o亚型(fox o)转录，下调β-连环蛋白(β-catenin)表达，引起一系列下游信号通路相关促成骨分化因子表达的改变，进而降低bmscs定向成骨分化能力及增殖活性。研究表明，硒元素具备良好的抗氧化性能，一些含硒化合物，比如亚硒酸钠能够抑制氧化应激对骨髓间充质干细胞产生的不良影响，并且抑制了氧化应激诱导细胞外信号调节激酶(erk)的激活，促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化。

4、但在目前应用骨组织工程治疗骨缺损的研究中，针对缺氧微环境，缺乏实时调控长期释放氧气的材料，用来改善种子细胞乏氧，帮助骨修复；针对高浓度活性氧微环境，缺乏实时调控生物活性药物释放的材料，用来提高种子细胞抗氧化能力，帮助骨修复。因此，有必要开发一种能调控氧气及含硒化合物长期释放的生物材料以促进骨修复。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的缺陷，本技术的目的在于提供一种水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用，该水凝胶材料具有超声响应功能，能够在超声辅助下调控氧气和含硒化合物的长期释放，有效促进骨修复。

2、为了达到上述目的，第一方面本技术提供了一种水凝胶制备材料，包括水凝胶基体前驱体、第一复合材料、光引发剂和水；

3、所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；

4、所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化硅；

5、所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；

6、所述液体氟碳化合物中负载有氧气。

7、所述水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所得水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所得水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。

8、所得水凝胶材料通过将第一复合材料负载在水凝胶基体上，一方面能够延长氧气和含硒化合物的缓释时间，另一方面能作为载体，易于填充在骨缺损处。

9、所得水凝胶材料通过将含硒化合物负载在第二复合材料表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。

10、所述水凝胶制备材料在使用时，可通过注射等方法引入到骨缺损处，经光照凝胶化，再经超声处理，缓释氧气和含硒化合物。

11、在一实施例中，所述第一复合材料的量为所述水凝胶制备材料的量的0.1％-0.5％(w/v)。在计算该比例时，所述第一复合材料的量的单位为g，所述水凝胶制备材料的量的单位为ml，其他类似计算同理。

12、在一实施例中，所述含硒化合物和所述第一复合材料的比例为34μmol:1mg。

13、第二方面，本技术提供了一种水凝胶材料，包括水凝胶基体和第一复合材料；

14、所述第一复合材料负载在所述水凝胶基体中；

15、所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；

16、所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化硅；

17、所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；

18、所述液体氟碳化合物中负载有氧气。

19、所述水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所述水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所述水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。

20、所述水凝胶材料通过将所述第一复合材料负载在所述水凝胶基体上，一方面能够延长氧气和含硒化合物的缓释时间，另一方面能作为载体，易于填充在骨缺损处。

21、所述水凝胶材料通过将含硒化合物负载在所述第二复合材料表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。

22、在一实施例中，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体的量的0.1％-0.5％(w/v)。

23、在一实施例中，所述含硒化合物和所述第一复合材料的比例为34μmol:1mg。

24、在一实施例中，所述第一复合材料中氧气的质量含量为0.16％。

25、在一实施例中，所述第一复合材料为纳米材料。所述第一复合材料为至少在一个维度上尺寸小于100nm的材料。

26、在一实施例中，所述含硒化合物包括硒代胱氨酸(sec)、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸中的至少一种，但并不局限于此。

27、在一实施例中，所述液体氟碳化合物包括全氟溴辛烷(pfob)、全氟己烷中的至少一种，但并不局限于此。

28、在一实施例中，所述水凝胶基体包括甲基丙烯酸酰化明胶(gelma)水凝胶、海藻酸钙水凝胶中的至少一种，其中甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的氨基取代度为90±5％，但并不局限于此。

29、第三方面，本技术还提供了一种所述水凝胶制备材料的制备方法，包括以下步骤：

30、将季铵盐表面活性剂溶解于第一水中，得到a液；

31、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于挥发性溶剂中，再加入液体氟碳化合物，混合均匀，得到b液；

32、将所述b液滴入所述a液中，超声乳化，得到c液；

33、将所述c液中的所述挥发性溶剂挥发除去，固液分离，清洗，得到表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

34、将表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物分散于第二水中，置于氧气气氛下和/或向所述第二水中通入氧气以使液体氟碳化合物吸收氧气，再加入醇溶剂，分散，然后加入氨水，继续分散，接着加入硅源进行第一反应，反应结束后固液分离，得到第二复合材料；

35、将含硒化合物配制成溶液，得到含硒化合物溶液；

36、将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散，固液分离，得到第一复合材料；

37、将水凝胶基体前驱体和光引发剂在水中溶解，得到水凝胶基体前驱体溶液；

38、将所述第一复合材料加入所述水凝胶基体前驱体溶液中，分散，得到水凝胶制备材料。

39、所述制备方法制得的水凝胶制备材料经光照处理制得的水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所得水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所得水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。

40、所述制备方法在制得第二复合材料后，才进行负载含硒化合物处理，这样含硒化合物负载在第二复合材料的表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。而将含硒化合物同聚乳酸-羟基乙酸共聚物一起加入挥发性溶剂中来制备表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，由于含硒化合物大多难溶于水及pfob，很难得到同时包裹pfob及含硒化合物的plga纳米颗粒，造成所得水凝胶的含硒化合物缓释效果很差。

41、在一实施例中，所述a液中季铵盐表面活性剂的含量为5mg/ml，所述b液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的含量为7mg/ml且液体氟碳化合物的体积百分含量为0.9％，所述b液和所述a液的体积比为1:4。在该条件下，液体氟碳化合物能很好的包裹在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的表面。

42、在一实施例中，所述超声乳化的功率为600w，总时间为10min，每超声2s停1s。在该条件下，所得c液乳化充分，确保后续除去挥发溶剂析出的至少部分表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物为纳米颗粒。

43、在一实施例中，在所述超声乳化过程中将所产生的白色絮状物除去。为了保证plga能完全包裹pfob，会加过量的plga，所以会有未溶解的plga析出，除去析出的plga更能够保证纳米体系的稳定。

44、在一实施例中，所述季铵盐表面活性剂包括溴代十六烷基三甲胺(ctab)、十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种，但不局限于此。

45、在一实施例中，所述挥发性溶剂包括丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种，但不局限于此。

46、在一实施例中，通过将所述c液置于通风处，或者利用鼓风工具对其鼓风，或者对其搅拌，或者采用上述方法中的至少两种以加快挥发性溶剂的挥发除去。另外，也可以将所述c液不经特殊处理，静置挥发除去其内挥发性溶剂。

47、在制备所述第二复合材料步骤中，为使所述表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的液体氟碳化合物吸收氧气，在一实施例中，将其置于可密闭的容器中，加入水分散，将该容器抽真空再通入氧气然后停止通气，在密闭环境下搅拌使液体氟碳化合物充分吸收氧气。在另一实施例中，将其置于可密闭的容器中，加入水分散，向所述第二水中通入氧气，然后停止通气，在密闭环境下搅拌使液体氟碳化合物充分吸收氧气。还可以在通入氧气前不进行分散，或者全程搅拌。也可以一直通入氧气，直至液体氟碳化合物充分吸收氧气。

48、在一实施例中，进行所述第一反应时，所用表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物、醇溶剂、氨水和硅源的比例为70mg：5ml：1.92ml：200μl，其中氨水浓度为25wt％。在该条件下，硅源发生充分分解，生成二氧化硅，而在表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面形成薄壳硅。

49、在一实施例中，所述第一反应的温度为20-35℃。在进行第一反应时，可以不需要进行加热或制备处理。所述第一反应的时间可以根据其反应温度进行调整。在一实施例中，所述第一反应的时间为24h。

50、在一实施例中，所述醇溶剂包括异丙醇，但不局限于此。

51、在一实施例中，所述硅源包括硅酸四乙酯，但不局限于此。

52、在一实施例中，所述含硒化合物溶液中含硒化合物含量为4.5mg/ml，所述第二复合材料和所述含硒化合物溶液的比例为20mg：10ml。在此条件下，所述第二复合材料上可以充分负载含硒化合物。

53、在一实施例中，所述将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散步骤中，在氧气气氛下分散时间为6h。

54、在一实施例中，所述含硒化合物溶液中的溶剂为ph值为2的水，如稀盐酸、稀硫酸等。

55、在一实施例中，所述水凝胶基体前驱体溶液中水凝胶基体前驱体的含量为100mg/ml，光引发剂含量为2.5mg/ml，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体前驱体溶液的量的0.1％-0.5％(w/v)。在该条件下，所述第一复合材料能充分负载在所得水凝胶基体上，并使所得水凝胶在超声辅助下很好的调控氧气和含硒化合物的长期释放。

56、在一实施例中，所述水凝胶基体前驱体包括甲基丙烯酸酰化明胶，但不局限于此。

57、在一实施例中，所述光引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(lap)，但不局限于此。

58、第四方面，本技术提供了一种水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：将所述水凝胶制备材料进行光照，得到水凝胶材料。光照波长和时间可以根据所使用的水凝胶基体前驱体和光引发剂的种类等进行调整。在一实施例中，将所述水凝胶制备材料在蓝光下进行照射以得到水凝胶材料，如在405nm波长的光下照射30s。

59、第五方面，本技术还提供所述水凝胶制备材料、所述水凝胶材料、所述制备方法制得的水凝胶制备材料或所述制备方法制得的水凝胶材料在制备超声辅助下促进骨修复的药物中的应用。所述药物包括但不局限于支架。

60、相比现有技术，本技术的有益效果在于：

61、(1)本技术水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；同时还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。

62、(2)本技术水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料具有超声相应功能，能很好应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境，有效促进骨修复。