一种金钗石斛有效部位及其制备方法与在制备具有抗乙肝作用的药物中的应用

本发明涉及天然药物化学，具体涉及一种金钗石斛有效部位及其制备方法与在制备具有抗乙肝作用的药物中的应用。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)是一种非细胞病变型dna病毒，是引起急性或慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因。据世界卫生组织统计，全世界有超过3.25亿人感染hbv，有约25％的患者在得不到及时救治的情况下发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌，并约有100万人/年死于相关疾病。病毒性肝炎成为全球公共卫生面临的重要威胁之一。尽管几十年来，预防接种hbv疫苗一直在多个国家推广并实施，但全球仍有约2.9亿人被统计为慢性乙型肝炎。目前批准治疗hbv的药物主要为核苷/核苷酸类似物和干扰素，但其长期用药导致的耐药或副作用大，及需要终身用药等问题限制了其临床使用。寻找或研发有效抗hbv的药物成为一项公共卫生挑战。中医药在防治慢性病或高致病性传染病中显示出了独特疗效和显著优势。因此，从天然中草药中寻找针对抗hbv药物具有非常大的前景。

2、金钗石斛(dendrobium nobile lindl.)为兰科石斛属植物，是我国传统的名贵中药材，享有“中华九大仙草之首”的美誉，药用历史悠久，始载于《神农本草经》。其性寒，味甘、淡、微咸，具有滋阴清热，生津止渴的功效，可用于治疗热病伤津、病后虚热等。现代药理学研究发现，金钗石斛的提取物或其单体成分具有抗肿瘤、抗衰老、降血糖、调血脂、神经保护、提高免疫力和抗病毒等作用。其中，其抗病毒活性主要表现为，所含有的多糖成分在体内对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯y病毒具有抑制活性；另有研究发现，石斛作为其中组分形成的复方-复方小花青风藤(由小花青风藤、三七、石斛组成)具有抗hbv活性。但单一的石斛或金钗石斛是否具有抗hbv活性，尚未有研究进行报道。《内经》中论述病毒性肝炎的中医病机，认为其“湿热相交，民当病疸”，湿热为其主要病因。

3、发明人在研究中发现，采用常规的提取以及萃取步骤得到的金钗石斛提取物显示出一定的抗hbv作用，但是其抗hbv作用不强，有待进一步提高。因此，以金钗石斛为原料，进一步开发一种具有更好抗hbv作用的有效部位，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，提供一种金钗石斛有效部位的制备方法，由该方法制备得到的金钗石斛有效部位的抗hbv作用效果显著。

2、本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

3、本发明首先提供了一种金钗石斛有效部位的制备方法，其包含如下步骤：

4、(1)将金钗石斛用乙醇提取，得金钗石斛乙醇提取物；

5、(2)将步骤(1)得到的金钗石斛乙醇提取物进行萃取，得到金钗石斛萃取物；

6、(3)将步骤(2)得到的金钗石斛萃取物进行硅胶柱层析，得到金钗石斛硅胶柱层析有效部位；取金钗石斛硅胶柱层析有效部位即得所述的金钗石斛有效部位。

7、本发明提供了一种全新的金钗石斛有效部位的制备方法；研究表明将金钗石斛先用乙醇提取以及乙酸乙酯萃取，再经硅胶柱层析制备得到的金钗石斛有效部位，其抗hbv作用相比于金钗石斛萃取物，得到了大幅的提高，具有显著的抗hbv作用。

8、优选地，步骤(1)所述的乙醇是指体积分数为50％～95％的乙醇。

9、最优选地，步骤(1)所述的乙醇是指体积分数为95％的乙醇。

10、优选地，步骤(1)乙醇与金钗石斛的用量比为5～20l:1kg。

11、最优选地，步骤(1)乙醇与金钗石斛的用量比为10l:1kg。

12、优选地，步骤(2)所述的金钗石斛萃取物的制备方法为：

13、将金钗石斛乙醇提取物混悬于水中得混悬液，接着加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得金钗石斛萃取物。

14、优选地，水与金钗石斛乙醇提取物的用量比为0.1～1l:1kg。

15、最优选地，水与金钗石斛乙醇提取物的用量比为0.3l:1kg。

16、优选地，乙酸乙酯与混悬液的体积比为3～10:1。

17、最优选地，乙酸乙酯与混悬液的体积比为5:1。

18、优选地，步骤(3)中硅胶柱层析的具体方法为：

19、将金钗石斛萃取物上硅胶柱，先用5～10倍柱体积的体积比为60～40:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用8～12倍柱体积的体积比为25～15:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱，并收集体积比为25～15:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得金钗石斛硅胶柱层析有效部位，取金钗石斛硅胶柱层析有效部位即得所述的金钗石斛有效部位。

20、最优选地，步骤(3)中硅胶柱层析的具体方法为：

21、将金钗石斛萃取物上硅胶柱，先用6倍柱体积的体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用10倍柱体积的体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱，并收集体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂体系洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得金钗石斛硅胶柱层析有效部位，取金钗石斛硅胶柱层析有效部位即得所述的金钗石斛有效部位。

22、在此，发明人需要说明的是，上述制备方法中，硅胶柱层析中的洗脱条件十分关键；不同硅胶柱洗脱条件洗脱下来的有效部位，其中的有效成分的组成和含量是完全不同的；硅胶柱洗脱条件的选择不当，并不能富集得到大量的具有抗hbv作用的有效成分，甚至富集不到具有抗hbv作用的有效成分。研究表明，只有在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的金钗石斛有效部位，其抗hbv作用相比于金钗石斛萃取物，才能得到大幅的提高；然而，在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的金钗石斛有效部位，其抗hbv作用相比于金钗石斛萃取物，并不能得到大幅的提高，甚至富集不到抗hbv作用的有效成分，反而会下降。

23、优选地，所述的金钗石斛有效部位的制备方法，还包括如下步骤：

24、进一步将步骤(3)得到的金钗石斛硅胶柱层析有效部位上凝胶柱，用甲醇进行洗脱，收集第3～5倍柱体积的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的金钗石斛有效部位。

25、发明人在研究中进一步发现，将金钗石斛硅胶柱层析有效部位在本法所述的凝胶柱洗脱条件下洗脱制备得到的金钗石斛有效部位，其具有十分优异的抗hbv作用，其抗hbv作用再次得到了进一步的提高。

26、优选地，所述的凝胶柱中的凝胶为交联葡聚糖凝胶lh-20。

27、本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的金钗石斛有效部位。

28、本发明还提供了一种上述金钗石斛有效部位在制备具有抗乙肝作用的药物中的应用。

29、有益效果：本发明提供了一种全新的金钗石斛有效部位的制备方法；研究表明将金钗石斛先用乙醇提取以及乙酸乙酯萃取，再经硅胶柱层析制备得到的金钗石斛有效部位，其抗hbv作用相比于金钗石斛萃取物，得到了大幅的提高，具有显著的抗hbv作用。由于本发明所述的金钗石斛有效部位具有显著的抗hbv作用；因此，将其作为活性成分用于制备具有抗hbv作用的药物具有重要的应用价值。