一种佐剂系统及其制备方法和应用与流程

本技术属于生物医药工程领域，特别涉及一种佐剂系统及其制备方法和其在免疫治疗及预防领域的应用。

背景技术：

1、佐剂(adjuvants)是非特异性的免疫调节剂，在疫苗中添加佐剂，可起到提高免疫反应强度、改变免疫反应类型、延长免疫反应持续时间等多种作用。特别是对免疫原性较弱的疫苗(如灭活疫苗、亚单位疫苗、重组蛋白疫苗、多肽疫苗等)，合理应用佐剂可提高疫苗在不同免疫背景人群中接种的阳转率。此外，添加佐剂可降低疫苗中抗原的用量，减少疫苗针次，有助于降低疫苗成本及解决疫情爆发时的产能问题。

2、铝佐剂作为免疫佐剂已经使用了很长的时间，其安全性与免疫增强作用早已被人们所证实。传统铝佐剂主要为铝盐(如硫酸铝、磷酸铝)或氢氧化铝粗颗粒，研究表明，相比于铝粗颗粒，纳米化的铝佐剂(简称纳米铝)颗粒更小，比表面积增大，吸附能力和佐剂活性更强，能提高机体的免疫应答，大大降低佐剂的副作用。

3、虽然铝佐剂成本低，但从免疫学的角度来讲，铝佐剂对某些疫苗候选抗原缺少佐剂效应或仅有较弱的佐剂效应，虽可增强体液免疫反应，但对细胞免疫没有强化作用，且在许多人用疫苗(尤其是重组蛋白疫苗和多肽疫苗)中没有明显的强化免疫反应的效果。因此，随着越来越多候选疫苗的涌现，对临床上可用的新型佐剂的需求正在快速增长。

4、乳剂型佐剂(包括水包油乳剂、油包水乳剂等)是新型佐剂的一个重要分支，乳剂可联合多种弱抗原(重组蛋白、多肽等)使用，并诱发高低度的抗原特异性抗体。乳剂型佐剂通常包含油相成分、水相成分和乳化剂。其中，水包油乳剂以水相成分为主，人体耐受性较高，且与多数疫苗抗原的相容性较好。不同的油相成分、水相成分及乳化剂混合后，各种成分的相互作用方式复杂多样，因此，采用不同配方制备的乳剂，其佐剂活性是难以预测的。

5、且有研究表明，单独使用抗原或仅应用某一种佐剂，其诱导的免疫应答强度偏低且偏向某一种类型，对改善抗原的反应强度、免疫力维持时间、免疫耐受等作用有限，而使用复合佐剂的疫苗可有望通过协同作用更为全面地活化免疫反应。

6、目前已上市的三种hpv疫苗，只有葛兰素史克的cervarix使用了复合佐剂(氢氧化铝和mpl)，表现出较高的免疫原性，但目前mpl为经化学处理“减毒”的沙门菌脂多糖，工艺复杂且成本高昂，产能容易受mpl的来源限制。另外，该产品在国内规模化生产条件不成熟，无法满足后续临床使用需求。而默沙东四价hpv疫苗gardasil和九价hpv疫苗gardasil 9均采用的是单一的磷酸铝佐剂，产出的抗体滴度远低于cervarix。

7、将不同类型佐剂配合研制复合免疫佐剂成为佐剂发展的新趋势，但不同机制的佐剂混合应用，是否具有互补性，其安全性和佐剂活性会发生何种变化，各佐剂组分以何种比例配制、采用怎样的制剂工艺可在确保安全性的前提下最大化免疫刺激活性，这些问题均无法预测，需要试验验证，也成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新的安全性和免疫刺激活性好，具有人体应用前景的佐剂系统及其制备方法和应用。铝佐剂与水相混合，作为新乳剂的水相，与油相分散和均质后获得复合纳米乳剂系统。

2、本发明人经研究出人意料地发现，采用恰当的配伍方式将水包油乳剂和铝佐剂进行组合，经分散、均质获得了纳米铝和吐温80作为油水界面稳定剂的复合纳米乳佐剂系统，具有更强的免疫刺激活性，且与hpv l1 vlp疫苗联合应用，可显著提高疫苗的免疫原性，产生与as04佐剂相当的有益效果。

3、本发明的技术方案如下：

4、本发明一方面提供一种佐剂系统，其包括水包油乳剂和均匀分散于所述水包油乳剂中的铝纳米颗粒，所述水包油乳剂包裹所述铝纳米颗粒形成乳滴，所述乳滴的粒径为100～250nm。

5、在一些实施方式中，所述铝纳米颗粒为选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝、或其混合形成的铝纳米颗粒。在一些实施方式中，所述铝颗粒是氢氧化铝纳米颗粒。铝颗粒的粒径为100～1000nm，优选粒径为100～800nm、100～500nm、100～400nm或100～250nm。优选地，所述氢氧化铝纳米颗粒在乳剂中的铝含量为0.5mg/ml～2mg/ml。更加优选地，所述氢氧化铝纳米颗粒在乳剂中的铝含量为2mg/ml。

6、在一些实施方式中，所述乳剂中含有油相和水相。

7、在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

8、在一些实施方式中，所述油相包含可代谢油，优选地，所述可代谢油为角鲨烯。

9、在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含α-生育酚。

10、在一些实施方式中，其中，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1，例如0.85-0.95，优选为0.9。

11、在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含司盘85。

12、在一些实施方式中，其中，其中角鲨烯与司盘85的重量比为8-10，优选为8.3。

13、在一些实施方式中，其中，所述油相进一步包含另外的免疫刺激剂。

14、在一些实施方式中，其中，所述免疫刺激剂为选自lps、mpl、3d-mpl或gla中的任意一种的tlr4激动剂。

15、在一些优选的实施方式中，所述免疫刺激剂是mpl。

16、在一些实施方式中，所述水相中含有吐温80；所述铝颗粒溶解在所述水相中。

17、在一些实施方式中，所述铝颗粒和吐温80的重量比为0.1-0.6，优选为0.13。

18、在一些实施方式中，其中，所述水相进一步包含另外的免疫刺激剂。

19、在一些实施方式中，其中，所述免疫刺激剂选自cpg、polyic、r837、r848中的任何一种或几种。

20、在一些优选的实施方式中，所述免疫刺激剂是cpg。

21、本发明另一方面提供一种制备所述的佐剂系统的方法，包括如下步骤：

22、a)准备铝纳米颗粒；

23、b)将步骤a)的铝纳米颗粒加入包含乳化剂的缓冲溶液中，制成复合水相；

24、c)制备油相，所述油相包含可代谢油；

25、d)将步骤b)的复合水相与所述油相混合，进行分散和均质，得到所述佐剂系统。

26、在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

27、在一些实施方式中，所述铝纳米颗粒为选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝或其中至少两种混合形成的铝纳米颗粒。

28、在一些实施方式中，所述水相与油相的比例为5-15ml水相:1g油相。

29、在一些实施方式中，所述可代谢油为角鲨烯。

30、在一些实施方式中，所述油相进一步包含α-生育酚或司盘85。

31、在一些实施方式中，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1，例如0.85-0.95，优选为0.9。

32、在一些实施方式中，角鲨烯与司盘85的重量比为8-10，优选为8.3。

33、在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。

34、在一些实施方式中，所述乳化剂为吐温80，所述铝佐剂与吐温80的重量比为0.1-0.6，优选为0.13。

35、在一些实施方式中，所述油相进一步包含另外的免疫刺激剂；优选地，所述免疫刺激剂为选自lps、mpl、3d-mpl或gla中的任意一种的tlr4激动剂。

36、在一些实施方式中，所述水相进一步包含另外的免疫刺激剂；优选地，所述免疫刺激剂选自cpg、polyic、r837、r848中的任何一种或多种。

37、在一些实施方式中，所述分散步骤包括在8000-10000rpm搅拌10-25min。

38、在一些实施方式中，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1.2bar、微射流阀80-160mpa压力下进行均质。

39、在一些实施方式中，所述均质步骤重复进行5-20个循环。

40、在一些实施方式中，所述均质步骤包括依次在狭缝式均质阀0.5-1bar、微射流阀80-140mpa压力下进行第一均质，然后在狭缝式均质阀1-1.2bar、微射流阀120-160mpa压力下进行第二均质，所述第二均质的压力分别大于所述第一均质的压力。

41、在一些实施方式中，所述第一均质进行5-10个循环，所述第二均质进行5-10个循环。

42、本发明另一方面提供一种免疫原性组合物，包括上述的佐剂系统，还包括至少一种抗原，所述抗原吸附在所述铝颗粒上、并均匀分散于所述乳剂中。

43、在一些实施方式中，所述抗原为一种或多种来源于细菌、病毒、寄生虫、真菌、肿瘤、人体自身抗原和/或变态反应原的抗原。

44、在一些实施方式中，所述抗原来源于人免疫缺陷型病毒、人乳头瘤病毒hpv、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒sars-cov-2中的至少一种。

45、在一些实施方式中，所述抗原来源于水痘带状疱疹病毒。

46、水痘带状疱疹病毒(vzv)是人类疱疹病毒之一。vzv糖蛋白e(glycoprotein e，ge)亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，ge由病毒的orf68基因编码，1872个碱基组成的该基因位于vzv基因组短片段区。在利用现代生物分子学技术制备重组vzv ge蛋白时，一般将截短ge蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区。葛兰素史克开发的shingrix是一种基于重组ge蛋白辅以新型佐剂as01b的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫苗在老年人中有着优于zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获fda批准上市。vzv ge蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。常常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。如本文中所使用的，ge蛋白是本领域技术人员公知的(参见，例如ncbi genbank数据库登录号：q9j3m8)。

47、利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：

48、(1)将本发明的ge蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；

49、(2)将步骤(1)所得的表达载体转染至cho细胞中；

50、(3)通过细胞群筛选和单克隆筛选，获得稳定表达ge蛋白的细胞株；

51、(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得vzv ge蛋白。

52、将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。

53、在一些实施方式中，所述抗原来源于冠状病毒，例如中东呼吸综合征冠状病毒(mers cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars cov)，尤其是新型冠状病毒sars-cov-2。

54、sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。rbd作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)为病毒s蛋白n端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人采用了一种包含sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)的受体结合结构域(rbd)或其功能活性片段和/或sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)n端结构域(ntd)或其功能活性片段的融合蛋白作为抗原。所述融合蛋白进一步包含foldon结构域或其功能活性片段。

55、在一些优选的实施方式中，所述抗原选自人乳头瘤病毒hpv6、11、18、31、33、45、52、58、68型中的至少一种。

56、hpv的衣壳是由主要衣壳蛋白l1和次要衣壳蛋白l2组成。已上市疫苗都是基于hpvl1病毒样颗粒(virus-like particle，vlp)为抗原的疫苗，通过基因重组表达的l1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。在ncbi数据库中，已有许多现有的hpv各型l1 vlp蛋白(hpv 16l1、18l1、6l1、11l1、31l1、33l1、45l1、52l1、58l1)序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人大部分采用了从现有技术中具有高度的保守性的序列，具体情况如下：hpv 6l1的氨基酸序列已于1995年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa74218；hpv 11l1的氨基酸序列已于1994年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa46935；hpv 16l1的氨基酸序列已于1998年在ncbi数据库中收录，登录号为aac09292.1；hpv 18l1蛋白的氨基酸序列已于2003年在ncbi数据库中收录，登录号为aaq92369.1；hpv 31l1蛋白的氨基酸序列已于1994年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa46956；hpv 33l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为acl12333.1；hpv 45l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为abp99831.1(截短了n端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响l1蛋白形成vlp，故而截短)；hpv52 l1蛋白的氨基酸序列已于2005年在ncbi数据库中收录，登录号为caa52590.1(截短了n端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响l1蛋白形成vlp，故而截短)；hpv 58l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为cax48979.1。

57、利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：在毕赤酵母中表达上述hpv各型l1 vlp蛋白的方法，包括下述步骤：

58、(1)将本发明的hpv各型l1蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；

59、(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母宿主菌中；

60、(3)通过菌株筛选，获得稳定表达hpv各型l1蛋白的菌株；

61、(4)使用步骤(3)所得的菌株进行表达，获得hpv各型l1蛋白。

62、将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。

63、需要说明的是，使用毕赤酵母表达系统稳定表达hpv各型l1蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献。本领域技术人员也可以选择例如大肠杆菌、酿酒酵母、汉逊酵母、cho细胞、昆虫细胞等在内的其他表达方式获得hpv各型l1蛋白。

64、在一些实施方式中，所述抗原含量在20-40μg之间，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:23-1:53。

65、在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:52.66，

66、在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:29.48。

67、在一些优选的实施方式中，所述抗原含量为20或40μg，所述铝颗粒与所述乳剂的质量比为1:23.62。

68、本发明另一方面还提供一种制备上述免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：

69、a)准备铝纳米颗粒；

70、b)将步骤a)的铝纳米颗粒加入包含乳化剂的缓冲溶液中，制成复合水相；

71、c)制备油相，所述油相包含可代谢油；

72、d)将步骤b)的复合水相与所述油相混合，进行分散和均质，得到所述佐剂系统；

73、e)将所述抗原添加到所述佐剂系统中，混合均匀，得到所述免疫原性组合物。

74、在一些实施方式中，步骤a)使用的铝佐剂为市售微米级别的铝佐剂(alhydrogel)。在一些实施方式中，步骤a)使用的铝佐剂为纳米级别的铝佐剂。

75、在一些实施方式中，步骤a)具体为取质量比为1:1:1的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后，加入1mol/l的alcl3溶液充分搅拌。缓慢滴加氨水，保持反应体系ph>10反应2小时，结束后加入丙酮破乳离心，弃上清，然后分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，将离心后的沉淀经干燥，即得到膨松的纳米氢氧化铝颗粒。

76、在一些实施方式中，步骤b)具体为将步骤a)制得的纳米氢氧化铝颗粒加入含有乳化剂的缓冲溶液中充分混合作为复合水相溶液。

77、在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯和α-生育酚充分混合作为油相。

78、在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯单独作为油相。

79、在一些实施方式中，步骤c)具体为将角鲨烯和司盘85充分混合作为油相。

80、在一些实施方式中，步骤d)具体为将步骤b)制得的复合水相溶液与步骤c)制备的油相充分混合，经高速搅拌，然后均质以降低粒径。经多次循环，最后利用0.22μm pes过滤器过滤乳剂，得到所述佐剂系统。

81、本发明提供了一种包含铝佐剂及乳剂的佐剂系统，尤其是一种包含均匀分散了氢氧化铝纳米颗粒的水包油乳剂的佐剂系统及其制备方法和应用。

82、相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

83、(1)适用范围广，纳米铝可吸附不同病原体的抗原，从而形成针对不同病原体的疫苗。

84、(2)稳定性高，纳米铝比表面积更大，吸附能力更强，且均匀分散于水包油乳剂中，保护抗原免遭接种环境物质破坏，增强体内外稳定性。

85、(3)安全性高，本发明的佐剂系统大大减少了铝佐剂的用量，且纳米铝分散在水包油乳剂体系中，能够显著减少接种部位不良反应。

86、(4)免疫诱导效力强，成本低，本发明的佐剂系统能有效增强疫苗的细胞免疫反应，其增强效果显著优于单一的乳剂或铝佐剂。尤其是应用于hpv抗原时，在降低成本的情况下仍能取得与专为hpv疫苗设计的as04佐剂相当甚至更优的效果。