高表达IL-10中性粒细胞外囊泡在颞下颌骨关节炎治疗中的应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及高表达il-10中性粒细胞外囊泡在颞下颌骨关节炎治疗中的应用。

背景技术：

1、颞下颌骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，tmj oa）是以进行性软骨退化、软骨下骨改建、滑膜炎和慢性疼痛为特征的退行性疾病，常有髁突骨质破坏，包括糜烂性吸收、硬化、磨损、骨赘形成等，引起关节的剧烈疼痛和功能障碍，严重影响患者的生活质量。机械负荷，局部炎症、软骨细胞凋亡都被认为是导致颞下颌骨关节炎的原因。关节腔灌洗、电物理治疗、关节腔注射药物、口服药物等保守治疗方式通过减轻关节疼痛、增强关节功能、延缓关节进行性破坏来达到治疗的目的。但是这些治疗策略难以修复和再生受损的颞下颌骨关节。

2、研究表明，中性粒细胞释放的微小囊泡（nev），可以累积在类风湿性关节炎患者的关节处，其可以穿透软骨，微囊泡上的抗炎膜联蛋白a1（anxn1）与其受体frp2发生相互作用，使tgf-β产生增加，引起软骨保护。然而，颞下颌骨关节炎患者瘤坏死因子-α（tnf-α）、白细胞介素-1β等促炎细胞因子异常增高，通过减轻炎症反应可以有效的干预颞下颌骨关节炎。其中，il-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，主要由抗原呈递细胞如活化的t细胞、巨噬细胞等细胞分泌，参与炎性反应和免疫反应，通过激活巨噬细胞抑制炎症细胞因子如tnf-α、il-6等促炎因子的表达，是巨噬细胞和其他抗原呈递细胞中免疫反应的主要抑制因子，具有较强的抗炎和组织再生能力。在多种炎症模型中，il-10均能显著抑制促炎因子产生，揭示其在颞下颌骨关节炎抗炎治疗中有重要的应用前景。但是，il-10在体内容易降解，影响其疗效，且药物的全身分布会产生毒副作用。因此，需要通过具有保护作用的载体将其递送至关节病灶部位。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中颞下颌骨关节炎治疗时缺乏在抑制炎症的同时又可以修复软骨的靶向药物的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本申请提供了il-10 nev在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。

4、优选的，所述中性粒细胞外囊泡靶向至软骨细胞，用以促进软骨细胞的增值和迁移。

5、本申请还提供了一种il-10 nev靶向药物的制备方法，包含以下步骤：

6、s1：获取il-10高表达的hl-60细胞；

7、s2：将s1中获得的hl-60细胞转化为中性粒细胞；

8、s3：收集中性粒细胞的细胞培养液，通过超速离心提取中性粒细胞外囊泡，获得il-10 nev靶向药物。

9、优选的，所述s1中通过il-10过表达质粒转染中性粒细胞的前体细胞。

10、优选的，所述s1的具体步骤为：

11、将hl-60细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，置于37 ℃、5％co2培养箱中培养；

12、当细胞密度在2-4 × 106个/ml时，用不含fbs和抗生素的rpmi-1640培养基培养，然后用cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒和相关转染试剂lipofectamine3000转染hl-60细胞6-8小时。

13、优选的，所述s2具体步骤为：收集s1中的hl-60细胞，通过终浓度为1% dmso刺激诱导hl-60细胞48小时，使其转化为中性粒细胞，然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时。

14、优选的，所述s3具体步骤为：

15、将收集到的细胞培养液在4 ℃下，分别在300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000 g离心30分钟，然后收集上清150000 g离心90分钟，获得负载il-10的中性粒细胞外囊泡，沉淀用无菌pbs（ph 7.4）重悬，-80 ℃保存。

16、与现有技术相比，本申请具有以下优点：

17、（1）利用hl-60细胞高表达il-10，然后诱导hl-60产生中性粒细胞，得到高表达il-10的中性粒细胞外囊泡，不仅提高了il-10的稳定性，还可以使其高效的递送至颞下颌骨关节病灶，减少其在其他脏器的分布，降低毒副作用。此外，在颞下颌骨关节病灶处释放出il-10，可以抑制促炎因子产生，达到改善颞下颌骨关节炎的目的。

18、（2）中性粒细胞外囊泡不仅靶向至颞下颌骨关节部位，其本身可以作用于软骨细胞，促进软骨细胞的增殖和迁移，从而保护软骨。

19、（3）本发明提出的负载il-10中性粒细胞外囊泡的制备方法，也可以用于其他细胞因子的表达，用于治疗相关疾病。

20、（4）本发明所使用的hl-60细胞来源广泛，数量充足，增殖快速，可以规模化生产。

技术特征：

1.il-10 nev在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述中性粒细胞外囊泡靶向至软骨细胞，用以促进软骨细胞的增值和迁移。

3.一种il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

4.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s1中通过il-10过表达质粒转染中性粒细胞的前体细胞。

5.根据权利要求4所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s1的具体步骤为：

6.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s2具体步骤为：收集s1中的hl-60细胞，通过终浓度为1% dmso刺激诱导hl-60细胞48小时，使其转化为中性粒细胞，然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时。

7.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s3具体步骤为：

技术总结
本发明提供高表达IL‑10中性粒细胞外囊泡（IL‑10 nEV）在颞下颌骨关节炎(TMG OA)治疗中的应用，涉及生物医药技术领域，本申请提供了高表达IL‑10的中性粒细胞外囊泡在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。本申请中利用HL‑60细胞高表达IL‑10，然后诱导HL‑60产生中性粒细胞，得到高表达IL‑10的中性粒细胞外囊泡。首先，中性粒细胞外囊泡本身可以和颞下颌骨关节病灶处软骨细胞发生相互作用，促进软骨的修复。其次，其不仅提高了IL‑10的稳定性，还可以使其高效的递送至颞下颌骨关节病灶，减少其在其他脏器的分布，降低毒副作用。此外，在颞下颌骨关节病灶处释放出IL‑10，可以抑制促炎因子产生，最终达到协同改善颞下颌骨关节炎的目的。

技术研发人员：郭悦华,冯兴梅,申娴娟,谢慧敏,钱俐,邓爱东
受保护的技术使用者：南通大学附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15