用于皮下注射的包含人透明质酸酶PH20变体和药物的药物组合物的制作方法

【】本公开文本涉及一种药物组合物，其包含具有提高的酶活性和热稳定性的人透明质酸酶ph20变体和一种或多种药物；以及使用所述药物组合物治疗疾病的方法。根据本公开文本的药物组合物可优选用于皮下注射。

背景技术

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背景技术：

1、应以高剂量或多剂量给予的药物(特别是抗体药物等)通常经由静脉内注射来给予，并且这种注射需要约90分钟或更长时间，静脉内注射还伴随另外的准备程序，因此对于患者、医生和医务人员来说都不方便，并且会产生另外的成本。相比之下，皮下注射具有能够立即给予的优点，但是与静脉内注射相比，吸收率相对较低，并且当注射量为3-5ml或更多时，它可能因为吸收缓慢发生而在注射部位引起肿胀和疼痛。由于这个原因，皮下注射蛋白质治疗剂通常限于少量的2ml或更少的溶液注射。然而，在透明质酸酶与治疗药物一起皮下给予(或皮下注射)后，分布在细胞外基质中的透明质酸在透明质酸酶的作用下被水解，从而皮下区域的粘度降低并且物质的渗透性增加，因此高剂量或多剂量的药物可以容易地递送到体内。

2、人类中有六种类型的透明质酸酶基因：hyal1、hyal2、hyal3、hyal4、hyalps1和ph20/spam1。hyal1和hyal2在大多数组织中表达，并且ph20/spam1(以下称为ph20)在精子细胞膜和顶体膜中表达。hyalps1不表达，因为它是假基因。ph20是一种酶(ec 3.2.1.35)，它切割n-乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸(构成透明质酸的糖)之间的β-1,4键。人透明质酸酶ph20的最佳ph为5.5，但即使在7-8的ph下也展现出一定的活性，而其他的人透明质酸酶(包括hyal1)的最佳ph为3-4，并且在7-8的ph下活性很弱。人的皮下区域的ph为约7.4，其大体上呈中性，因此在各种类型的透明质酸酶中，ph20被广泛应用于临床应用。ph20的临床应用的例子包括皮下注射抗体治疗剂，其在眼科手术中用作眼部松弛剂和麻醉添加剂；用于通过水解肿瘤细胞的细胞外基质中的透明质酸来增加抗癌治疗剂进入肿瘤细胞的通路；以及用于促进组织中过多存在的体液和血液的吸收。

3、同时，目前可商购的ph20是呈从牛或绵羊的睾丸提取的形式。其例子包括(牛透明质酸酶)和(绵羊透明质酸酶)。

4、牛睾丸透明质酸酶(bth)是通过在翻译后修饰过程中从牛野生型ph20去除信号肽和c末端上的56个氨基酸而获得的。bth也是一种糖蛋白，并且基于其包括氨基酸的总组成，具有5％的甘露糖含量和2.2％的葡萄糖胺含量(borders和raftery,1968)。当将动物来源的透明质酸酶以高剂量反复给予至人体时，可以产生中和抗体，并且除ph20外还含有的作为杂质的其他动物来源的生物材料可能引起过敏反应。特别地，由于担心疯牛病导致从牛提取的ph20的使用受到限制。为了克服这些问题，已经进行了关于重组人ph20蛋白的研究。

5、已经报道了重组人ph20蛋白在酵母(巴斯德毕赤酵母)、ds-2昆虫细胞、动物细胞等中表达(chen等人,2016，hofinger等人,2007)。在昆虫细胞和酵母中产生的重组ph20蛋白在翻译后修饰过程中的n-糖基化模式方面与人ph20不同。

6、在透明质酸酶中，已经鉴定出hyal1(pdb id：2pe4)(chao等人,2007)和蜂毒透明质酸酶(pdb id：1fcq、1fcu、1fcv)的蛋白质结构。hyal1由两个结构域构成，即催化结构域和egf样结构域，并且催化结构域呈(β/α)8的形式，其中α螺旋和β链(这是二级蛋白质结构的特征)各重复八次(chao等人,2007)。在其中hyal1的c末端被不同地剪接的变体中，egf样结构域是完全保守的。hyal1与ph20的氨基酸序列具有35.1％的同一性，并且尚未发现ph20的蛋白质三级结构。

7、在人ph20的结构/功能关系研究中，发现ph20的c末端区域对于蛋白质表达和酶活性很重要，并且具体地，已经报道了用氨基酸477-483终止c末端对于酶的表达和活性很重要(frost,2007)。全长ph20(氨基酸1-509)或具有在位置467处被截短的c末端的ph20变体的活性仅是具有在位置477至483中的一个位点处被截短的c末端的ph20变体的活性的10％或更小(frost,2007)。halozyme therapeutics开发了rhuph20(氨基酸36-482)，它是一种重组蛋白，其中成熟ph20的c末端在y482处被切割(bookbinder等人,2006；frost,2007)。

8、同时，尽管正在进行研究以开发使用人ph20的皮下注射形式的各种治疗药物，但是人ph20本身的低稳定性的问题仍未解决。

9、在此技术背景下，本公开文本的发明人证实了人ph20变体(包括野生型透明质酸酶ph20的氨基酸序列中的α-螺旋8区(s347至c381)和在α-螺旋7与α-螺旋8之间的接头区(a333至r346)中的一个或多个氨基酸残基取代，并且其中位于ph20的n末端和/或c末端处的一些氨基酸被切割)具有很高的酶活性和热稳定性，并且因此为此提交了专利申请(pct/kr 2019/009215)。

10、本技术的发明人还证实，根据本公开文本的ph20变体可应用于药物组合物或配制品，所述药物组合物或配制品包含药物(例如抗体药物，特别是高剂量抗her2抗体或免疫检查点抗体)，并且因此根据本公开文本的药物组合物和配制品(包含ph20变体以及药物，诸如抗her2抗体或免疫检查点抗体)可用于皮下注射，并且药物(诸如抗体药物)和ph20变体的活性非常稳定并且可以维持很长时间，从而完成本公开文本。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、【技术问题】

2、因此，本公开文本是针对上述问题进行的，并且本公开文本的一个目的是提供一种新型药物组合物，其包含具有提高的酶活性和热稳定性的ph20变体和药物，其中所述药物和所述ph20变体的热稳定性和活性可以维持很长时间；特别是可用于皮下注射的药物组合物。

3、本公开文本的另一个目的是提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者给予根据本公开文本的药物组合物。

4、【技术解决方案】

5、根据本公开文本，上述和其他目的可以通过提供药物组合物来实现，所述药物组合物包含(a)药物和(b)ph20变体。

6、根据本公开文本的药物组合物中包含的ph20变体可以包含具有seq id no:1的氨基酸序列的野生型人ph20中的选自s343e、m345t、k349e、l353a、l354i、n356e和i361t的一个或多个氨基酸残基取代；并且可以进一步包含选自α-螺旋8区(s347至c381)和/或在α-螺旋7与α-螺旋8之间的接头区(a333至r346)的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸残基取代，其中位于n末端和/或c末端的一些氨基酸残基被选择性地切割。

7、根据本公开文本的药物组合物可以进一步包含选自药学上可接受的添加剂，特别是缓冲液、稳定剂和表面活性剂的一种或多种。

8、根据本公开文本的药物组合物可以以用于皮下注射的注射配制品的形式使用。