一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用与流程

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用。

背景技术：

1、外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、"运载物"和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

2、外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。一类外泌体中常见的细胞质蛋白是rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(gtpases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称rab4，rab5和rab11主要出现在早期以及回收的核内体中，rab7和rab9主要出现在晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种rab蛋白。除了rab蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白(包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(cd63，cd81和cd9)、热休克蛋白家族(hsp60，hsp70，hspa5，cct2和hsp90)以及一些细胞特异性的蛋白包括a33(结肠上皮细胞来源)、mhc-ⅱ(抗原提呈细胞来源)、cd86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶(gapdh，烯醇化酶1，醛缩酶1，pkm2，pgk1，pdia3，gstp1，dpp4，ahcy，tpl1，抗氧化蛋白，p4hb，ldh，亲环素a，fasn，mdh1和cnp)、核糖体蛋白(rps3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子，arf1，cdc42，人类红细胞膜整合蛋白，slc9a3r1)、粘附因子(mfge8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素等。

3、多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。但不同种类的细胞产生的外泌体具有不同的功能，如肿瘤细胞分泌的外泌体能够促进肿瘤的生长及转移，干细胞分泌的外泌体能够进行免疫调节，外泌体的功能主要由其母细胞决定。

4、干细胞作为万能细胞，其在延缓衰老、调节机体免疫、修复受损组织等方面展现出强大的能力，而这些功能的发挥主要是由干细胞分泌的外泌体(旁分泌)完成的，因此，干细胞外泌体具有巨大的应用空间。

5、虽然培养的细胞均能产生外泌体，但通过普通培养细胞的方式产生的外泌体数量有限，且不能使不同批次间的外泌体质量稳定可控，不利于开发为产品。此外，细胞在培养过程中把外泌体分泌到培养基上清液中，但上清液中除了外泌体，还有其他杂质。传统纯化方式是通过梯度离心或者peg沉淀法来获得较纯的外泌体，但这些方法要么对纯化的体积有要求，要么会引入有害的杂质，均不利于外泌体产品的规模化开发。最后，由于外泌体是杯状囊泡结构，自身比较脆弱，需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面带来了许多不便。因此，需要研究一种能保证外泌体活性和稳定性的方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用，提高外泌体在储存、运输过程中的活性和稳定性。

2、为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：

3、一方面，本发明提供一种外泌体冻干粉，包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白。

4、优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01-1：0.01-0.1：0.5-5：0.01-0.5：0.01-0.5(ml：g：g：g：g：g)。

5、进一步优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.1-0.3：0.03-0.07：1-3：0.05-0.2：0.05-0.2(ml：g：g：g：g：g)。

6、最优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(ml：g：g：g：g：g)。

7、优选地，所述外泌体为干细胞外泌体。

8、进一步优选地，所述外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。

9、优选地，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：

10、(1)细胞复苏；

11、(2)扩增培养；

12、(3)发酵罐培养；

13、(4)收集上清液；

14、(5)外泌体纯化。

15、进一步优选地，步骤(1)中，所述细胞复苏的条件为37±2℃恒温复苏，复苏时间不超过3min。

16、进一步优选地，步骤(2)中，所述扩增培养的条件为温度37±1℃、co2浓度5±0.5％。

17、进一步优选地，步骤(3)中，所述发酵培养的参数为ph：7.20±0.05，温度：37℃，do(溶氧浓度)：40.0±20.0％，转速：40±2rpm。

18、进一步优选地，步骤(5)中，所述纯化为依次进行梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌。

19、更进一步优选地，所述梯度过滤纯化用囊式滤器进行，优选为1.5+0.8μm囊式滤器。

20、更进一步优选地，所述超滤浓缩使用中空纤维超滤膜进行，更进一步地，所述中空纤维超滤膜为300kd，所述浓缩的倍数为5-20倍，进一步优选为10倍。

21、更进一步优选地，所述溶液置换使用pbs(磷酸缓冲盐溶液)进行。所述pbs添加体积为浓缩液的2-8倍，进一步优选为4倍。

22、所述溶液置换进行3-5次，进一步优选为4次。

23、进一步优选地，所述过滤除菌使用除菌滤器进行，优选为孔径为0.45+0.22μm除菌滤器。

24、作为本技术的一个具体实施方式，所述步骤(5)包括以下步骤：

25、(1)梯度过滤纯化

26、用1.5+0.8μm囊式滤器进行纯化：用pbs进行过滤器的润洗，后进行上清收获液的过滤，压力不超过0.1mpa。最后使用适量pbs冲洗过滤器并将冲洗液与干细胞上清收获液的滤后液一起混合收集。

27、(2)超滤浓缩

28、用300kd中空纤维超滤膜将过滤好的上清液进行超滤浓缩，浓缩8-12倍。

29、(3)溶液置换

30、添加pbs与浓缩液混合均匀，pbs添加体积为浓缩液的4倍，混合均匀后继续使用中空纤维超滤膜浓缩至浓缩液的体积，此过程重复进行4次。

31、(4)过滤除菌

32、使用0.45+0.22μm除菌滤器对外泌体进行过滤，滤液收集至无菌容器中，用nta测定得到的外泌体浓度。根据测定结果，在生物安全柜内，用无菌pbs稀释至1.0×1010particles/ml，并分装至无菌试剂管，放置-20℃以下储存备用。

33、作为本技术的一个具体实施方式，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：

34、(1)细胞复苏

35、将脐带间充质干细胞37±1℃恒温复苏，复苏时间不得超过3min。

36、(2)扩增培养

37、按照每个细胞培养器接种细胞数量为4.0～8.5×107个，体积为800～1000ml，将细胞接种至细胞培养器中，拧紧容器盖子后，颠倒摇晃培养器使细胞悬液分布均匀并铺满层底面，放入37±1℃、5±0.5％ co2培养箱中培养。

38、(3)发酵罐培养

39、将扩增培养得到的细胞种子加入到罐子中，细胞总数在3～5×108个，按照ph：7.20±0.05，温度：37℃，do：40.0±20.0％，转速(rpm)：40±2的培养参数进行发酵培养。

40、(4)收集外泌体

41、发酵罐停止搅拌，待载体静置沉底，将罐内的上清液排出并收集。

42、(5)外泌体纯化。

43、另一方面，本发明提供上述外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

44、将配方用量的外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白，和水混匀，后经过冷冻干燥制成冻干粉。

45、优选地，所述冷冻干燥的程序为：

46、

47、

48、进一步优选地，所述冷冻干燥的程序为：

49、

50、。

51、最后，本发明提供上述外泌体冻干粉在制备促进创伤修复药物中的应用。

52、本发明的有益效果为：

53、(1)本发明的外泌体制备方法在发酵罐中进行、纯化方法依次经过梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌，以上方法均可规模化进行，且获得的冻干粉活性高、纯度高，不但解决了外泌体规模化生产、纯化问题，还提高外泌体在储存、运输过程中的活性和稳定性。

54、(2)具体来看，本发明的冻干粉配方针对所用的外泌体进行了改进，通过选择甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白作为冻干辅助材料，可以显著提高冻干粉的储存稳定性和活性，以上组合材料中的任一成分均缺一不可。

55、(3)本发明进一步对冻干粉配方的组成比例进行了优化，最终得到外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01-1：0.01-0.1：0.5-5：0.01-0.5：0.01-0.5(ml：g：g：g：g：g)这一配比下，尤其是外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(ml：g：g：g：g：g)这一配比下，可以获得更好的储存稳定性和活性。

56、(4)本发明的冻干粉配方需要配合一定的冻干程序，本发明采取梯度升温、降温、再升温的方法，利用二次降温过程中水分的形态变化，避免冻干粉结构坍缩，提高冻干粉稳定性和活性。进一步地，本发明进一步提出了该冻干过程中的最适宜温度和时间，该条件下获得的冻干粉具有更高的储存稳定性和活性。