基于生物3D打印的人造子宫内膜及其制备方法

本发明属于人造子宫内膜，具体涉及基于生物3d打印的人造子宫内膜及其制备方法。

背景技术：

1、人造子宫的三要素为：人造子宫内膜，人造羊水，人造子宫的其他组件建造，子宫内膜是哺乳动物子宫内壁的一层组织，分为致密层、海绵层和基底层。人造子宫内膜在生物学性质上尽可能地贴近自然的子宫内膜，至少要求粘膜上皮细胞，需注意的是人子宫内膜存在凋亡小体，子宫、卵巢和输卵管等器官都会发生程序化细胞死亡。当然，要想尽可能地贴近自然子宫的生理学特性，人造子宫还需要许多子宫内膜细胞因子。例如表皮生长因子(egf)可刺激子宫内膜腺上皮和间质增生，促进子宫内膜前列腺素e2(pge2)释放；血小板生长因子可刺激间质细胞本身或其临近上皮细胞的增生，然而市面上各种的人造子宫内膜仍存在各种各样的问题。

2、如授权公告号为cn109381743a所公开的3d打印人造子宫内膜及其制备方法和应用，其虽然实现了人造子宫内膜可作为针对人造子宫内膜相关疾病的病理生理机制研究工具，也可作为针对调控和影响胚胎着床过程的相关因子的筛选模型，还可作为任何因素引起的子宫内膜病变的直接或间接相关疾病的预防或治疗研究工具，但是并未解决现有人造子宫内膜存在的无法实现模拟实际母体子宫的情况，以及不能够有效的仿真子宫内膜的致密层、海绵层的问题，为此我们提出基于生物3d打印的人造子宫内膜及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于生物3d打印的人造子宫内膜及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于生物3d打印的人造子宫内膜，人造子宫内膜机体包括有致密层、海绵层、基底层和支撑聚合网，所述支撑聚合网采用3d打印制备，所述支撑聚合网的原料采用的是胶原、软骨素、matrigel以及搭配聚乙交酯-丙交酯，将胶原、软骨素、matrigel以及聚乙交酯-丙交酯进行混合搅拌，然后通过3d打印机进行打印出所述支撑聚合网，然后再将所述基底层种植在所述支撑聚合网的外侧，所述致密层和所述海绵层种植在所述支撑聚合网的内侧，并且所述致密层种植在所述所述支撑聚合网的贴合内侧，所述海绵层种植在所述致密层的内侧。

3、优选的，所述致密层和所述海绵层设置在子宫内膜表面2/3部分，并且所述致密层和所述海绵层受雌激素影响产生周期性变化；所述基底层为子宫内膜靠近子宫肌层的1/3部分，并且所述基底层不受雌激素影响，不产生周期性变化。

4、优选的，所述致密层、所述海绵层、所述基底层的选取采用的是抗cytoker-atin-18及抗desmin抗体对分离的子宫内膜上皮细胞及基质细胞进行免疫组织化学分析，分离的子宫内膜细胞纯度＞90％，所述子宫内膜上皮细胞包括有海绵层和所述基底层。

5、优选的，所述致密层、所述海绵层、所述基底层的培养是将分离的子宫内膜上皮细胞及基质细胞分别种植于培养瓶，取对数生长期的细胞，胰酶消化制备基质细胞悬液用于接种，将三维支架置于24孔板内，按2×105/cm2的密度接种细胞，在细胞培养箱静止3h，补加含10％胎牛血清的dmem∶f12为1∶1培养液1ml，72h后将上皮细胞以同样密度接种于聚合网的另一面，加入培养液，置5％co2、37℃孵箱内培养，每两天更换一次培养液。

6、优选的，所述人造子宫内膜机体在体外培养子宫内膜活检置于冷无菌磷酸盐缓冲盐水溶液中，立即使用精细解剖钳和手术刀切成约1mm的碎片，然后在24孔培养板中进行培养；每孔加入0.6ml/孔199培养基中的纤维蛋白原5mg/ml溶液，与20l凝血酶混合，在血块形成后，子宫内膜碎片迅速放置在孔的中心，并被另外0.6ml/孔的纤维蛋白原/凝血酶溶液覆盖，以使其保持在两个血块之间的相同水平。

7、优选的，所述冷无菌磷酸盐缓冲盐水溶液含2.5g/ml两性磷酸盐缓冲盐水和50g/ml庆大霉素，所述子宫内膜活检在使用前被清除残留的凝块并放置在冷无菌磷酸盐缓冲盐水溶液中，所述凝血酶中包括有50nihu/ml和0.15m氯化钠。

8、优选的，所述子宫内膜活检在进行培养的时候，添加6％热灭活胎牛血清、0.2％氨基己酸、l-谷氨酰胺和抗生素，并且将所述人造子宫内膜机体在37℃、95％空气/5％二氧化碳的湿化环境中培养100天，每3天更换一次培养基，每天观察所述人造子宫内膜机体，每3天用相位对比显微镜拍照进行观察，所述抗生素中包括有链霉素50g/ml、青霉素50iu/ml和两性霉素b2.5g/ml。

9、优选的，所述人造子宫内膜机体中充入人造羊水，并且在所述人造子宫内膜机体的外侧搭建人造子宫的其他组件，所述人造羊水是促进胎儿生长的营养物质和生长因子，含有水和电解质，还包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、抗生素以及尿素；所述人造子宫的其他组件包括有无泵动静脉血液循环系统、连续液体交换的封闭流体环境和脐带血管通路，所述无泵动静脉血液循环系统是将脐带血管与体外氧合器相连，利用胎儿自身心脏的跳动驱动血液循环，所述连续液体交换的封闭流体环境是用透明的聚乙烯薄膜将外界隔绝，人工配置的羊水从一端流入，另一端流出，供给胎儿营养，清除代谢产物，所述脐带血管通路通过插管于脐动脉，并使套管与胎儿腹壁之间保持天然脐带长度，通过对胎儿的实时监测显示，被支持的胎儿维持了稳定的血流动力学，有正常的血气和氧合参数，并保持了胎儿循环通畅，在适当的营养支持下，胎儿表现出正常的体细胞生长、肺成熟、脑生长和髓鞘形成。

10、基于生物3d打印的人造子宫内膜的制备方法，包括有以下步骤：

11、s1、子宫内膜样本进行选取：将子宫内膜样本置于冷无菌磷酸盐缓冲盐水溶液中，然后使用精细解剖钳和手术刀切成约1mm的碎片，进行培养处理；

12、s2、子宫内膜样本进行选取：将子宫内膜样本碎片溶液中加入2.5％pancreatin和0.5％trypsin，4℃、1.5h，再置20℃、0.5h，通过涡流旋转器旋转10s，静置5min，弃去上1/3悬液，吸取下2/3细胞悬液于含胎牛血清的离心管内，离心后获子宫内膜上皮细胞，再将培养的子宫内膜样本碎片溶液置于含0.05％-0.02％trypsin-edta离心管中，37℃、20min，涡流旋转器旋转10s，吸取细胞悬液于含fcs离心管中，吸取上清液，离心，获子宫内膜基质细胞；

13、s3、3d打印支撑聚合网：将胶原、软骨素、matrigel以及聚乙交酯-丙交酯进行混合搅拌，然后通过3d打印机进行打印出支撑聚合网；

14、s4、将子宫内膜上皮细胞和子宫内膜基质细胞进行种植：将子宫内膜上皮细胞种植在支撑聚合网的内侧，并且将子宫内膜基质细胞种植在支撑聚合网的外侧，并且人造子宫内膜机体在37℃、95％空气/5％二氧化碳的湿化环境中培养100天，每3天更换一次培养基，每天观察所述人造子宫内膜机体，每3天用相位对比显微镜拍照进行观察，抗生素中包括有链霉素50g/ml、青霉素50iu/ml和两性霉素b2.5g/ml，使得子宫内膜上皮细胞和子宫内膜基质细胞能够在支撑聚合网的两侧生成致密层、海绵层和基底层；

15、s5、充入人造羊水和搭建人造子宫的其他组件：在人造子宫内膜机体中充入人造羊水，并且搭建人造子宫的其他组件，使得人造子宫内膜机体能够仿真模拟人体子宫。

16、优选的，所述人造子宫的其他组件中还用于向人造子宫内膜机体中输送免疫球蛋白g抗体、血清素和胎盘激素，所述免疫球蛋白g抗体对保护免疫系统未发育完备的新生命非常重要，所述胎盘激素也控制胎儿生长，所述血清素用于对胎儿提供促进大脑发育，所述人造子宫内膜机体还要保持温度调节、适当的刺激和微生物刺激，提高模拟母体。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明通过支撑聚合网实现对人造子宫内膜机体进行支撑，然后通过基底层实现对人造子宫内膜机体进行防护，或者是实现对人造子宫内膜机体进行有效的实现粘连，以及通过致密层和海绵层实现模拟子宫的内层，便于胎儿进行着床和生长，并且对于支撑聚合网采用3d打印处理，提高支撑聚合网的整体性，以及便于实现对基底层、致密层和海绵层进行种植，并且对于基底层、致密层和海绵层采用培养繁殖，然后进行种植处理，有效的形成人造子宫内膜机体。