一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法及用途

本发明涉及一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法及用途，属于医药。

背景技术：

1、水蛭是中国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后入药，在《神农本草经》中已有记载，具有很高的药用价值。《中国药典》2020版列载，水蛭为水蛭科动物蚂蟥(whitmania pigra whitman)、水蛭(hirudo nipponica whitman)或柳叶蚂蟥(whitmaniaacranulata whitman)的干燥全体，具有治疗中风、高血压、清瘀、闭经、跌打损伤等功效。近年新发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效。

2、水蛭的主要有效药用成分为大分子类化合物，如水蛭素、肝素、组织胺、吻蛭素以及氨基酸等。其中，水蛭素是目前鉴定出的最强的凝血酶特异性抑制剂，是一种含有65个氨基酸残基的单链多肽。药理学研究表明：水蛭素等多肽类成分具有抗凝血、抗血栓形成、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、抗组织纤维化等作用。

3、“龙丹通络胶囊”(国药准字b20020853)是集心脑血管保健，预防、治疗为一体的纯中药产品，是哈尔滨圣泰生物制药有限公司主打品牌，甲类otc药品，国家中药保护品种，其中，水蛭是处方中的主要药物，具有益气活血，祛瘀通脉的功效。用于气虚血瘀型脑血栓形成恢复期或冠心病轻中度稳定型劳累性心绞痛，表现为气虚血瘀证者的康复保健，能从根本上预防心脑血管疾病的产生，并对已患心脑血管疾病有非常显著的效果。

4、“龙丹通络胶囊”成药中，以水蛭生粉入药，然而，由于水蛭药材在贮藏过程中易霉变，其药材细粉在固体制剂中微生物超标严重，导致“龙丹通络胶囊”的卫生学指标难以控制，极大地限制了药理药效及临床治疗。

5、目前，中药制剂常用的灭菌方法包括：水洗灭菌法、化学灭菌法、干热灭菌法、射线灭菌法等，但这些方法在应用中也存在一定的缺点：水洗灭菌法只适用于中药材初步处理，去除附着于药材表面的灰尘及细菌；化学灭菌法利用化学试剂处理药材，经处理后的药材会有化学试剂残留；干热灭菌法对药材进行加热处理，温度较高，会使动物药中所含的蛋白质变性，不利于动物药材的活性成分提取；射线灭菌法中常用的包括微波灭菌法、60co-γ射线灭菌法、紫外灭菌法。但紫外线穿透能力弱，只适用于药材表面的灭菌。60co-γ射线灭菌法需要特殊的核辐照装置，对60co-γ射线的人身安全防护亦有特殊要求，限制了大量制药生产企业和高校院所等研发机构的应用。

6、现阶段水蛭溶栓有效组分的常用提取方法有：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流法等，但这些方法存在着损失多、周期长、工序多、提取效率不高的特点。

7、因此，采用科学可靠的灭菌技术，优化提取工艺，以控制水蛭药材的微生物菌落含量，有效提高水蛭中溶栓活性多肽组分的提取率，保证“龙丹通络胶囊”的临床用药安全、有效尤为重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，水蛭药材卫生学指标难以控制的问题，提供了一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，可有效控制微生物含量，该法采用蜗牛酶-nacl酶降解溶剂系统、罐组动态逆流提取、高速离心、al2o3陶瓷膜分离、喷雾干燥技术提取水蛭溶栓有效组分，工艺流程简单，操作方便。

2、同时，本发明提供一种具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。

3、同时，本发明提供一种具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

5、一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，包括以下步骤：

6、s01，取水蛭药材，粉碎，过筛，微波辐照灭菌，微波辐照功率为400～1000w，辐照时间为2～8min，获得灭菌水蛭药材；

7、s02，运用三套罐组动态逆流提取技术对灭菌水蛭药材中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材重量10～15倍的0.3％～0.9％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600～1200ku/kg灭菌水蛭药材作为提取溶媒，ph6.0～8.0，提取温度35～45℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为60～90min；b罐提取时间为15～40min；c罐提取时间为0～25min；提取阶段，各罐提取时间2.0～3.0小时，提取期间逆流循环3～5次，每次逆流循环15～25分钟，获得提取液；

8、s03，对上述提取液进行高速离心，转速为5000～8000rpm，离心至少20分钟，得离心分离液；

9、s04，对离心分离液进行微滤，得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。

10、s03中，采用碟片式离心机进行离心操作。

11、s04中，微滤的方法为膜分离微滤分离，膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05μm，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05μm膜芯61根，共488根；运行条件：温度：35～50℃、出膜压力：1.0～2.0bar；微滤分离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：35～50℃、顶洗压力：7.0～10.0bar，得微滤透过液。

12、s01中，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min。

13、s01中，过筛为过40目筛。

14、蜗牛酶的提取方法包括以下步骤：采用木瓜酶0.05％～0.15％w/v-甘露醇0.1％～0.3％w/v-司盘20 0.05％～0.1％w/v溶剂系统，溶解于ph6.0～8.2的0.01～0.03mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、20％～40％w/v浓度的(nh4)2so4溶液500～1000ml，溶液总量共计1000～1500ml；

15、取去壳蜗牛，冰浴条件下至少12000rpm高速匀浆10～15min，对蜗牛酶进行萃取，萃取完成后进行活性炭脱色1～2h，活性炭的添加重量为去壳蜗牛重量的0.1％，再用0.9％nacl溶液过滤洗涤除去活性炭，0.9％nacl溶液的用量相当于去壳蜗牛重量的1～2倍量，获得蜗牛粗蛋白溶液，蜗牛粗蛋白溶液中，至少62％的蜗牛粗蛋白得率；

16、采用聚乙二醇peg2000～4000结合葡聚糖凝胶sephadexg-25～100柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶液溶解于相当于蜗牛粗蛋白溶液重量1～4倍量的tri-hcl buffer溶液中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与聚乙二醇peg2000～4000按照1:3～1:8的重量比例在0～4℃混合均匀，反应1～4h；获得蜗牛粗蛋白与peg2000～4000复合物，过滤，将蜗牛粗蛋白与peg2000～4000复合物50g溶解于200mltri-hcl buffer溶液，上样于采用同一缓冲液tri-hcl buffer平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-25～100层析柱，0.20～0.60mol/lnacl溶液梯度洗脱3～6个柱体积，每0.1～0.3个柱体积收集一次，流速0.8～1.0ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，3000～5000rpm磁力搅拌除盐，经冷冻干燥，获得纯度高于85％的蜗牛酶粉末。

17、tri-hcl buffer溶液为0.03～0.06mol/l，ph 7.4～8.0。

18、葡聚糖凝胶sephadexg-25～100层析柱的径高比1:5～1:8。

19、本发明的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。

20、本发明的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。

21、本发明具有如下有益效果：

22、蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，具有较强的生物转化能力，可以用于酵母细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。与传统的酶解法(如：胃蛋白酶、胰蛋白酶等)相比较，采用蜗牛酶-nacl溶剂体系提取水蛭溶栓活性组分，可最大限度的保留其溶栓活性组分，酶解条件温和、活性物质溶出快速，且蜗牛酶提取方法简单可行，转化率高，分离纯化容易，对环境无污染，适合工业化生产。

23、本发明用于水蛭药材灭菌的微波辐照功率为400～1000w，辐照时间为2～8min，其中，辐照功率为800w，3min的水蛭提取物的溶栓活性最强。本发明采用微波辐照技术对水蛭药材进行灭菌，具有灭菌快速、彻底、穿透力强、不污染环境、能耗低的优点；灭菌效果显著，可有效控制微生物含量，符合卫生学指标；操作过程在常温下进行，不会导致水蛭药材温度升高，可以防止溶栓有效组分失活，保证了“龙丹通络胶囊”的用药安全、有效。微波灭菌不仅可以在短时问内达到很好的灭菌效果，效率高而且杀菌效果好，更能减少能量消耗和环境污染，对人体不产生核辐射损伤。本发明采用微波辐照技术的另一个主要原因是水蛭中的溶栓活性组分为多肽类物质，属于热敏感性药物成分，而微波辐照短时间内不会引起被辐照物的温度明显升高，对热敏性中药的杀菌有一定的优越性，同时由于大规模的样品灭菌非常便捷且成本低，只要合理的控制好微波功率和灭菌时间，可在药材贮藏及药物制剂生产灭菌过程中广泛应用。

24、本发明同时添加药材10～15倍的0.3％～0.9％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600～1200ku/kg药材作为提取溶媒，运用三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。本发明采用蜗牛酶-nacl酶降解溶剂系统、罐组动态逆流提取、高速离心、al2o3陶瓷膜分离、喷雾干燥技术提取水蛭溶栓有效组分，工艺流程简单，操作方便。其中，利用三套罐组动态逆流提取方法，有利于水蛭中的溶栓有效成分的富集，它集萃取、重渗漉、动态和逆流技术为一体，具有节省溶剂、能耗低、提取效率高等优点，适合工业化生产。

25、本发明为解决现有水蛭溶栓有效组分提取工艺效率不高的问题，提供一种新型蜗牛酶-nacl溶剂系统结合罐组动态逆流提取技术，对水蛭中的溶栓有效组分进行富集，可提高有效成分收率，减少活性组分损失，缩短生产周期，通过与传统提取溶剂及传统提取方式对比，本发明可明显提高水蛭中溶栓活性多肽组分的提取效率。