人脐带间充质干细胞及其外泌体在制备治疗生理性睾丸衰老及相关疾病的药物中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及人脐带间充质干细胞及其外泌体在制备治疗生理性睾丸衰老及相关疾病的药物中的应用。

背景技术：

1、睾丸衰老包括年龄相关的生理性睾丸衰老，以及各种致病因素导致的睾丸早衰和病理性睾丸衰老，它们的机制存在本质差异，治疗方案难以有效运用；目前对于各类睾丸衰老的治疗都尚未有比较好的治疗方案。其中，生理性睾丸衰老是指随着年龄增长而出现的睾丸结构和功能逐渐衰退的过程，表现为雄激素缺乏、生精功能减退及生育力下降。其中，雄激素缺乏主要表现为血清睾酮浓度下降，并引起性功能障碍、肌肉萎缩、骨质疏松、肥胖和代谢综合征等全身症状。这一系列临床综合征又被称为迟发性性腺功能减退症(late-onset hypogonadism，loh)。目前针对生理性睾丸衰老，临床治疗方法主要是利用外源性药物进行睾酮替代治疗(testosterone replacement therapy，trt)。目前临床上广泛使用的trt尽管可恢复血清睾酮水平，然而由于睾酮分泌受下丘脑-垂体-性腺轴调控，trt治疗虽可缓解睾丸衰老的部分临床症状，但trt难以模仿血清睾酮水平存在的日节律和年节律，并不能完全代替内源性睾酮的作用，并且存在负反馈抑制下丘脑-垂体-性腺轴、抑制睾丸生精功能、增加前列腺癌发病风险等副作用。因此亟需研发用于治疗生理性睾丸衰老，改善loh症状的新方法。

2、干细胞具有自我更新和多向分化潜能，是实现细胞再生的“种子”，机体可通过自体干细胞的增殖和分化实现细胞更新；但各个组织器官的干细胞数量会随着年龄的增长而逐渐减少，增殖分化能力也会下降，故而受损的组织器官无法得到及时修复，导致人体衰老或疾病的发生。由于其分化能力、体外扩增和营养物质的释放，以及免疫调节特性，间充质干细胞(mscs)是组织修复和治疗各种疾病的合适候选者，例如糖尿病、器官移植、移植物抗宿主病、心血管、炎症、肝脏、肺、肾脏、神经、自身免疫、骨骼和软骨疾病。由于采用非侵入性分离方法，无伦理问题，免疫原性较低，自我更新能力更快，倍增时间更稳定，增殖效率更高，与其他msc来源相比，人脐带间充质干细胞(hucmsc)是细胞疗法和再生医学的首选。jiesun和somia h.abd allah等课题组发现，针对乙烷二甲烷磺酸盐(ethanedimethanesulfonate，eds)和白消安诱导的病理性睾丸衰老动物模型，hucmsc睾丸内移植可以被诱导分化为睾丸间质细胞和生精细胞，提高血清睾酮水平。然而，这些报道都是采用乙烷二甲烷磺酸盐(ethane dimethanesulfonate，eds)和白消安诱导的病理性睾丸衰老动物模型，不同于生理性睾丸衰老。

3、目前没有利用脐带间充质干细胞及其外泌体治疗生理性睾丸衰老的报道。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，旨在提供人脐带间充质干细胞及其外泌体在制备治疗生理性睾丸衰老及相关疾病的药物中的应用。

2、本发明的首要目的是提供间充质干细胞或其外泌体在制备治疗生理性睾丸衰老的药物中的应用。

3、本发明的另一目的是提供间充质干细胞或其外泌体在制备治疗迟发性性腺功能减退症的药物中的应用。

4、本发明的又一目的是提供间充质干细胞或其外泌体在制备提高生精功能的药物中的应用。

5、本发明的又一目的是提供间充质干细胞或其外泌体在制备延缓衰老性生育力下降并提高生育能力的药物中的应用。

6、本发明的又一目的是提供间充质干细胞或其外泌体在制备治疗睾丸间质细胞衰老的药物中的应用。

7、本发明的又一目的是提供一种治疗生理性睾丸衰老的药物。

8、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

9、外泌体(exosome)是一种由细胞主动分泌的直径在40nm～200nm的微囊泡，内含多种生物活性物质，主要由蛋白质、核苷酸(dna、mrna、microrna、lncrna、circrna等)和脂类等组成。外泌体具有高稳定性、易于储存、便于定量使用以及向损伤处募集等优势，其磷脂双分子层膜结构可以有效保护内容物，避免被胞外各种酶类所降解，并使其稳定进入受体细胞以调控细胞的基因表达和功能改变。外泌体作为治疗产品较干细胞制剂具有明显的优越性，可代替干细胞发挥修复治疗多种器官及组织损伤的功能，避免了干细胞直接移植存在的免疫排斥等多种风险，同时外泌体稳定性高、易于储存、可量产、可质控，作为“无细胞的干细胞治疗技术”显示出独特的优势。而外泌体的获取对治疗效果的影响也比较关键。

10、本发明从培养人脐带间充质干细胞的培养基上清液中分离得到人脐带间充质干细胞外泌体，并且研究得出该人脐带间充质干细胞外泌体具有延缓老年小鼠生理性睾丸衰老的作用，因此，间充质干细胞及其外泌体在制备治疗生理性睾丸衰老的药物中的应用，应在本发明的保护范围内。所述治疗生理性睾丸衰老包括延缓睾丸衰老，具体包括降低睾丸中衰老相关标志物p21、p16、γ-h2a的表达水平，促进睾丸细胞增殖，增加睾丸重量，减少睾丸间质sa-β-gal阳性细胞，减少睾丸tunel阳性细胞。

11、本发明研究得出，人脐带间充质干细胞外泌体对血清睾酮水平、肌肉质量和力量、睾丸体积和重量、睾丸组织衰老标志物和生精功能标志物等均具有改善和提高作用，对于迟发性性腺功能减退症有良好的治疗效果，因此，间充质干细胞及其外泌体在制备治疗迟发性性腺功能减退症的药物中的应用也应在本发明的保护范围内。

12、此外，本发明研究得出，人脐带间充质干细胞外泌体具有提高从精原细胞到精子细胞的各阶段生精细胞的数量，具有提高生精功能的作用，因此，间充质干细胞及其外泌体在制备提高生精功能的药物中的应用也应在本发明的保护范围内。所述提高生精功能具体是促进生理性衰老睾丸生精功能恢复，包括改善睾丸生精小管形态，增加小管数量，增厚生精上皮，增加从精原细胞到精子细胞的各阶段生精细胞。

13、本发明还研究得出，人脐带间充质干细胞外泌体具有延缓衰老性生育力下降并提高生育能力的作用，因此，间充质干细胞及其外泌体在制备延缓衰老性生育力下降并提高生育能力的药物中的应用也应在本发明的保护范围内。所述延缓衰老性生育力下降并提高生育能力包括延缓附属性腺衰老和全身肌肉衰老，增大增粗肛提肌，增加胫骨前肌肌纤维，提升肌肉拉力。

14、人脐带间充质干细胞外泌体可提高血清中睾酮的含量，提高睾丸间质细胞的数量，促进睾丸间质细胞功能的恢复，提高睾酮合成功能，同时使肛提肌增大，增加胫骨前肌肌纤维的数量，提升肌肉拉力，因此，间充质干细胞及其外泌体在制备延缓/治疗睾丸间质细胞衰老的药物中的应用也应在本发明的保护范围内。

15、优选地，上述间充质干细胞外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。

16、本发明还提供了一种治疗生理性睾丸衰老的药物，含有间充质干细胞或其外泌体。

17、优选地，还含有药学上可接受的辅料。

18、优选地，所述间充质干细胞外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。

19、优选地，所述外泌体的制备方法为：

20、s1.间充质干细胞培养：

21、s11.间充质干细胞培养至细胞融合80％～90％时传代，培养至第3～5代；

22、s12.步骤s1培养至第3～5代，在细胞长到70％～80％后，将培养基中的fbs更换为无外泌体血清的fbs，继续培养4～6天，每2～3天收集细胞上清液；

23、s2.外泌体分离：

24、收集的上清液以超速离心法分离，具体是先以200～400g离心8-12min去除完整细胞取上清，再8000g～12000离心25～35min去除细胞碎片取上清；然后将上清以80000g～120000g离心60～80min获取外泌体沉淀，用pbs重悬沉淀后再以80000g～120000g离心60～80min去除外泌体中的杂质蛋白，获得外泌体沉淀；

25、s3.外泌体确认：

26、通过检测沉淀物中的粒子大小、透射电镜观察、检测外泌体标记物cd9、cd63和cd81的表达，来确认外泌体。

27、优选地，步骤s11中培养所用培养基为含10％胎牛血清、4ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子的dulbecco改良的eagle培养基/f12。

28、优选地，步骤s11中培养条件为在35～38℃、4％～6％ co2条件下培养间充质干细胞。最优选为在37℃、5％ co2条件下培养。

29、优选地，步骤s2中超速离心法分离的具体方法是：先以300g离心10min去除完整细胞取上清，再10000g离心30min去除细胞碎片取上清；然后将上清以100000g离心70min获取外泌体沉淀，用pbs重悬沉淀后再以100000g离心70min去除外泌体中的杂质蛋白，获得外泌体沉淀。

30、优选地，步骤s3中外泌体确认标准是：(1)粒子直径为40nm～200nm，(2)透射电镜观察外泌体形状呈圆形或杯口状，(3)标记物cd9、cd63和cd81阳性。

31、本发明具有以下有益效果：

32、本发明分离得到人脐带间充质干细胞外泌体(humsc-exo)，并且发现，humsc-exo对血清睾酮水平、肌肉质量和力量、睾丸体积和重量、睾丸组织衰老标志物和生精功能标志物等均具有改善和提高作用，表明humsc-exo不仅具有传统的trt能够提高睾酮水平的优点，还具有延缓生理性睾丸衰老、改善睾丸生精功能的作用，对于迟发性性腺功能减退症有良好的治疗效果，humsc-exo可作为延缓生理性睾丸衰老、改善生精功能、提高睾酮水平的一种新方法。