一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用

本发明属于生物制品，具体涉及一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用。

背景技术：

1、近年来，随着生物纳米材料技术飞速发展和新型疫苗佐剂平台的迅速开发，纳米递送系统凭借高效安全和可修饰性的优势成为十分有潜力的新型疫苗佐剂。目前常用的佐剂包括铝佐剂与油包水佐剂等，这些传统佐剂虽然能诱导体液免疫但却无法有效诱导细胞免疫应答，导致免疫增强效果有限。而与传统佐剂相比纳米佐剂的优势体现在纳米尺寸效应、携载抗原能力、抗原缓释和可修饰性方面，能够快速的诱导抗体产生并维持更长的免疫持续期，同时有效地促进机体细胞免疫应答的产生，从而增强免疫效果。

2、纳米颗粒作为纳米递送系统中的一种，能够通过修饰吸附或包埋抗原，实现缓释、靶向等多种功能，在提高机体体液免疫的同时通过激活抗原呈递细胞和淋巴细胞提高细胞免疫水平从而增强抗原免疫原性，获得更强的免疫应答效果和抗体水平。目前作为抗原递送系统的纳米颗粒主要包括脂质体、金属纳米粒子、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、多糖类物质等。

3、在众多纳米颗粒材料中，多糖类物质来源广泛易得、成本低廉、生物安全性高、易于修饰，常用于纳米递送系统的构建。壳聚糖作为一种天然阳离子多样，具有良好的生物相容性，通过对其进行季铵化修饰可以进一步提高壳聚糖的水溶性，并且引入电荷以提高其生物功能。多糖可促进免疫调节，具有多靶点、多功能和多因子效应，作为疫苗佐剂具有广泛的应用前景。多糖的化学成分、结构和构象在很大程度上决定其生物活性，通过修饰改变其结构和构象能够增强其生物活性。硫酸化修饰后的多糖聚阴离子特性显著增强，可显示出强负电荷特征并能够显著提高与阳离子和细胞膜结合的能力。目前，已有多糖作为佐剂的相关研究，但仍存在很多问题，例如佐剂成分复杂、水溶性差、免疫增强效果参差不齐等。这些问题导致了多糖佐剂制作和保存运输成本高，且在临床使用时免疫增强效果并不理想。因此，亟需研制一种新型、高效的佐剂，能有效激活细胞免疫及体液免疫，提高抗体水平，为机体提供安全稳定、强大的免疫保护。

技术实现思路

1、本发明的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖来自于卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529菌种，该菌种为已公开菌种，其保藏编号为gdmccno.62094，记载于专利文献cn114891657a中。

2、本发明的目的是提供一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其应用，通过对壳聚糖进行季铵化修饰以及对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖进行硫酸化修饰，通过季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，该纳米颗粒能有效吸附装载抗原，从而实现了抗原和疫苗佐剂的共同递送。该纳米颗粒佐剂能够高效诱导体液免疫与细胞免疫应答，显著提高血清中特异性抗体的滴度。

3、一方面，本发明提供一种纳米颗粒佐剂的制备方法，包括壳聚糖和免疫刺激剂，上述免疫刺激剂为卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖，壳聚糖与卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，本发明上述自组装形成纳米颗粒的方法包含：

4、对壳聚糖进行季铵化修饰，同时对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖进行硫酸化修饰，将得到的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖作为物理交联剂，将季铵化修饰的壳聚糖滴加于硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖溶液中，20℃混合30min，即得自组装纳米颗粒。优选地，上述季铵化修饰的壳聚糖溶液中季铵化修饰的壳聚糖的初始浓度为0.25-0.5mg/ml，上述硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖初始浓度为0.05-0.1mg/ml。所述的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529为本实验室分离保存的益生菌菌株。

5、优选的，上述季铵化壳聚糖的制备方法包括：将壳聚糖溶于10％乙酸溶液中(ph＝4.5)，40℃搅拌12h充分溶胀，加入苯甲醛搅拌反应1h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干；产物溶于异丙醇中，加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，70℃搅拌16h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干；产物溶于盐酸乙醇溶液中，20℃搅拌24h，加入丙酮后离心收集沉淀，得到季铵化修饰的壳聚糖(ohtcc)。

6、优选的，上述硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖制备方法包括：0℃条件下向无水吡啶中缓慢滴加氯磺酸，剧烈搅拌30min，将卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖粉末加入无水甲酰胺中，溶解后加入无水吡啶与氯磺酸混合物中，50℃搅拌反应3h，p h调至中性，加入无水乙醇静置16h，离心收集沉淀，冷冻干燥收集得到硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖。

7、本发明中，上述纳米颗粒佐剂的制剂为液体形式。通过自组装制得的纳米颗粒形态规则、粒径均一且分散性良好，能够有效吸附抗原，有利于抗原呈递细胞识别抗原，提高抗原的免疫原性，进一步的激活机体细胞免疫和体液免疫应答，有效提高特异性抗体水平和中和抗体效价，同时本发明制备得到的纳米颗粒具有良好的稳定性，4℃保存4周内纳米颗粒性状稳定，方便运输、储存和使用。

8、本发明还提供了一种上述纳米颗粒佐剂在制备疫苗中的用途，目的是制备一种能够减少抗原用量，诱导更高水平细胞免疫与体液免疫反应的纳米级疫苗组合物。

9、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

10、上述疫苗组合物包括纳米颗粒佐剂与抗原，所述纳米颗粒佐剂包括壳聚糖和卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖，所述壳聚糖与卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，所述抗原吸附装载于纳米颗粒表面；

11、上述抗原吸附装载于纳米颗粒表面的方法为：对壳聚糖进行季铵化修饰，同时对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖进行硫酸化修饰，将得到的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖作为物理交联剂，将季铵化修饰的壳聚糖滴加于硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus dc529胞外多糖溶液中，在20℃下400rpm混合30min，随后将抗原蛋白逐滴加入至纳米颗粒溶液中，在20℃下400rpm混合30min，既得吸附装载有抗原蛋白的纳米颗粒。

12、优选地，上述季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusdc529胞外多糖体积比为1∶1-2，抗原蛋白与纳米颗粒体积比为1∶2。

13、优选的，上述疫苗组合物的粒径可达到35.58nm，抗原蛋白吸附装载率达65.66％。

14、本发明中，上述抗原包括但不限于重组蛋白抗原、合成的多肽抗原、灭活病毒或dna疫苗等。

15、与现有传统疫苗佐剂相比，本发明具有以下优点：

16、1、本发明中利用季铵化壳聚糖和硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusdc529胞外多糖制备的纳米颗粒性状均一、稳定性较好，能够有效吸附装载抗原，将抗原高效递送至免疫细胞，有利于抗原递呈细胞对抗原的识别和结合。

17、2、本发明中的纳米颗粒作为佐剂能够诱导产生有效的免疫反应，显著提高机体细胞免疫和体液免疫水平，诱导产生更高水平的特异性抗体和中和抗体效价。

18、3、本发明中的纳米颗粒佐剂能有效递送不同类型的抗原，显著提高抗原的免疫原性，有效减少抗原的使用量。本发明纳米佐剂中含有的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacilluscrispatus dc529胞外多糖能够有效激活机体免疫应答，快速产生高水平抗体，增加亚单位疫苗的保护效果。

19、4、本发明中的纳米颗粒佐剂为水性佐剂，性质稳定易于吸收，所选择的成分生物安全性高，对机体无副反应。