一种基于叶黄素近红外光响应的新型PEG-OE-L嵌段共聚物制备方法及靶向药物释放与流程

本发明涉及一种基于叶黄素近红外光响应的新型peg-oe-l嵌段共聚物制备方法及靶向药物输送，具体是指以叶黄素、peg和原酸酯为原料，通过酯化和酰胺化反应合成出目标产物peg-oe-l，制备peg-oe-l双响应性脂质体(dr-lips)应用于靶向药物输送。

背景技术：

1、脂质体是由磷脂双分子层构成的小囊泡，具有改善难溶性药物生物利用度和减少副作用的优良特性。因此，脂质体在药物传递方面被广泛认可。然而，脂质体的机械稳定性较差和渗漏性限制了其在纳米医学中的应用。为了增强磷脂双分子层的膜结构，研究人员一直在探索脂质体膜的性质和组成及如何通过物理和化学刺激反应机制来控制靶向药物的传递和释放[1-3]。

2、为了增强脂质体的结构稳定性，研究人员着重调节其结构特征，如膜流动性、磷脂的排列顺序和磷脂头基之间的立体排斥。这些特征与磷脂和锚定分子之间的非共价相互作用密切相关。为了达到这个目标，研究人员研究了各种可作为膜稳定剂的化合物，包括胆固醇、甾醇衍生物以和极性类胡萝卜素[1-3]。虽然胆固醇是常用的稳定剂，但它在血液中含量过高会引起各种健康问题，包括动脉粥样硬化、心血管和中风等疾病。极性类胡萝卜素具有通过垂直插入脂质双层并锚定在双分子层的两侧来调节膜稳定性的独特能力[5]。极性类胡萝卜素不仅可以改变微观极性，还可以改变膜的相转变温度，显著提升膜的整体稳定性和完整性[6]。叶黄素(l)是一种具有共轭双键的典型类胡萝卜素，其两端为含有羟基得酮环结构，它们的取向和空间位置的差异会影响脂质双层的结构稳定性。此外，叶黄素还表现出良好的抗氧化、抗癌和抗炎等多种活性，使其成为食品、制药和化妆品行业中具有吸引力的添加剂。因此，叶黄素的独特性能使其成为有前景的替代胆固醇候选物质。

3、光敏感脂质体是由卵磷脂和含有关键紫外线(uv)光敏基团如聚偶氮苯、香豆素和硝基苯的嵌段聚合物组成的纳米颗粒[7-9]。叶黄素对蓝光和紫外光有光敏性，并能激活光动力学降解。因此，它在光敏嵌段聚合物的设计中起着至关重要的作用。然而，蓝光和紫外线对组织的渗透性较差，会损伤正常组织和细胞。相比之下，近红外(nir)光具有更深的组织穿透性，对细胞损伤的较低，使其成为生物医学的首选。ce6通过近红外线照射，产生ros杀死癌细胞。因此，在光动力学过程中使用ce6作为光敏剂，提供足够的能量和ros来诱导叶黄素的氧化降解。叶黄素和ce6的组合将叶黄素及其嵌段共聚物的光响应从蓝光延伸到nir光，从而增强基于叶黄素的嵌段共聚物纳米颗粒的组织渗透并改善其靶向药物释放。此外，肿瘤组织的ph值通常低于正常组织，而原酸酯具有优异的生物相容性和ph敏感性，因此它们可以用于ph响应纳米载体。

4、[1]wu h.；yu m.；miao y.cholesterol-tuned liposomal membrane rigiditydirects tumor penetration and anti-tumor effect.acta pharm.sin.b.2019，9，858-870.

5、[2]tai k.；liu f.；he x.the effect of sterol derivatives on propertiesof soybean and egg yolk lecithin liposomes：stability，structure and membranecharacteristics.food research international.2018，109，24-34.

6、[3]zhou y.-m.；liu x.-c.；li y.-q.synergy between plant phenols andcarotenoids in stabilizing lipid-bilayer membranes of giant unilamellarvesicles against oxidative destruction.soft matter，2020，16(7)：1792-1800.

7、[4]kumar，s.-v.；taylor，g.；hasim，s.；collier，c.-p.；morrell-falvey，j.lossof carotenoids from membranes of pantoea sp.yr343results in altered lipidcomposition and changes in membrane biophysicalproperties.biochim.biophys.acta，biomembr.2019，1861，1338-1345.

8、[5]widomska，j.；kostecka-guga，a.-a.；latowski，d.；gruszecki，w.-i.；strzalka，k.calorimetric studies of the effect of cis-carotenoids on thethermotropic phase behavior of phosphatidylcholinebilayers.biophys.chem.2009，140，108-114.

9、[6]gruszecki，w.-i.；sujak，a.；strzalka，k.；radunz，a.；schmid，g.-h.organisation of xanthophyll-lipid membranes studied by means of specificpigment antisera，spectrophotometry and monomolecular layer technique luteinversus zeaxanthin.z.naturforsch.，c：j.biosci.2015，54(7-8)，517-525.

10、[7]kumar，pramanik，-s.；losada-pérez，p；reekmans，g.physicochemicalcharacterizations of functional hybrid liposomal nanocarriers formed usingphoto-sensitive lipids.sci.rep.2017，7，1-9.

11、[8]fomina，n.；sankaranarayanan，j；almutairi，a.photochemical mechanismsof light-triggered release from nanocarriers.adv.drug delivery rev.2012，64，1005-1020.

12、[9]yavlovich，a.；smith，b.；gupta，k.light-sensitive lipid-basednanoparticles for drug delivery：design principles and future considerationsfor biological applications.mol.membr.biol.2010，27，364-381.

技术实现思路

1、在本发明中，基于叶黄素和原酸酯类的ph和光敏双重特性，提出了一种新型的具有膜稳定性和双重敏感靶向药物传递特性的peg-oe-l混合聚合物及其双响应性脂质(dr-lips)设计。这种脂质体可以在磷酸盐缓冲液(pbs)中自组装并封装药物(ptx和ce6)，形成ptx和ce6负载的双响应性脂质体(ce6+ptx/dr-lips)。在被肿瘤细胞内吞并照射后，它们经历水解和光解作用，快速释放药物进入细胞质。因此，在光动力疗法过程中使用ce6光敏剂，提供足够的能量和强氧化性ros诱导叶黄素的氧化降解。

2、本发明通过叶黄素和ce6的结合，将叶黄素及其嵌段共聚物的光响应范围从蓝光扩展到近红外光，从而增强基于叶黄素嵌段共聚物纳米颗粒的组织穿透性，并改善其靶向药物释放的性能。设计思路如图1

3、本发明包括以下步骤：

4、步骤1：叶黄素琥珀酸酯的合成

5、叶黄素和琥珀酸酐按摩尔比1∶2～8溶解在二氯甲烷中，料液比(质量体积比g/ml)1∶5～20，再加入反应料液体积0.5～5％三乙胺，在避光条件下，于30～50℃反应10～30h。然后向反应体系内加入料液等体积的水继续反应0.5～2h，静置分层后除去水层，用蒸馏水洗涤有机相2～5次，真空蒸馏除去有机溶剂，浓缩物在5～30℃低温下真空干燥，得到橘红色叶黄素琥珀酸酯。

6、步骤2：peg-oe嵌段共聚物的制备

7、2，2，2-三氟-n-(2-甲氧基)-[1，3]-二氧戊环-4-亚甲基和peg按摩尔比1∶0.2～0.5溶解在甲苯中，料液比为(质量体积比g/ml)1∶5～50，蒸馏除水，然后添加0.5％～2％摩尔的2，2，2-三氟-n-(2-甲氧基)-[1，3]-二氧戊环-4-亚甲基的催化剂1，于氮气保护下在110～130℃反应10～24h。反应结束后冷却至室温，加入2～5倍反应液的冷乙醚混合，过滤，滤渣在室温下真空干燥，得到产物1。然后将产物1在氢氧化钠和四氢呋喃的混合液中，按料液比为(质量体积比g/ml)1∶4～20，在室温下搅拌反应8～24h。反应后通过旋转蒸发去除四氢呋喃，经1000～3000da透析袋透析去除小分子杂质，真空冷冻干燥得到嵌段共聚物peg-oe。步骤

8、步骤3：peg-oe-l嵌段共聚物的制备。

9、将peg-oe、叶黄素二琥珀酸酯、hbtu按摩尔比1∶0.8～2∶2～5溶解于二氯甲烷中，料液比为(质量体积比g/ml)1∶5～20，加入少量三乙胺在氮气保护下室温下反应2～8h。反应液用等体积的碳酸氢钠溶液萃取三次，去除杂质后收集有机相。蒸发有机溶剂后，真空干燥8～24h，得到peg-oe-l

10、步骤4：peg-oe-l嵌段共聚物脂质体制备

11、将聚合物peg-oe-l与卵磷脂按照质量比例5∶95～50∶50混合，溶解于有机溶剂中，旋转蒸发形成薄膜，随后用pbs(ph为7.4的磷酸盐缓冲液)溶液水化10～60min，然后超声2～20min，形成脂质体。

12、步骤5：peg-oe-l嵌段共聚物脂质体靶向输送

13、将peg-oe-l脂质体靶向输送ce6和ptx药物，peg-oe-l和药物以摩尔比1∶0.2～2协同构成，对ptx和ce6的药物包封率分别为80～93％和85～91％，在近红外光(660nm)照射下具有光响应。

14、进一步的，所述步骤2催化剂1是由吡啶和p-tsa组成，吡啶和p-tsa的摩尔比例为1∶0.2～1。步骤2所用的原料2，2，2-三氟-n-(2-甲氧基)-[1，3]-二氧戊环-4-亚甲基、peg(2k)和有机溶剂甲苯都需要进行干燥除水处理。优选将2，2，2-三氟-n-(2-甲氧基)-[1，3]-二氧戊环-4-亚甲基1～3g和peg(2k)5～15g溶解在100～500ml的甲苯中，在110～130℃下油浴，蒸馏除水，等有机溶剂被蒸发出80％～95％后停止蒸馏，使体系内含水量小于10ppm，冷却至室温，向混合溶剂中添加催化剂1，继续进行反应。氟乙酰化基团进行脱保护的碱性条件为2～8％的氢氧化钠溶液和四氢呋喃按体积比为1∶2～6进行混合。

15、进一步的，所述peg-oe-l嵌段共聚物具有化学结构特征为：

16、

17、oe：

18、

19、l：

20、

21、peg：

22、

23、其中n范围值20-200，优选peg200～3000。

24、进一步的，所述peg-oe-l嵌段共聚物合成路线如图2。peg-oe、叶黄素琥珀酸酯、peg-oe-l的结构采用核磁共振氢谱表征，如图3～5，peg-oe-l分子量用凝胶色谱表示，如图6。

25、进一步的，所述peg-oe-l嵌段共聚物脂质体(dr-lip)呈球形，大小均匀；脂质体的zeta电位在-25.62～-44.45mv之间，具有良好的稳定性。储藏一个月后，脂质体的粒径，药物包封率，zeta电位等参数储藏前分比为58±1.5nm、ee％(ptx)94.2±2.3、ee％(ce6)88.2±2.3、-44.5±4.2mv，储藏一个月后分别为59±1.7nm、ee％(ptx)92.3±2.2、ee％(ce6)86.2±2.3、-41.2±3.7mv，变化不显著，具有良好的储藏稳定性。

26、本发明将叶黄素和peg-oe-l与ce6共混后，经660nm的光激发照射后可加快叶黄素和peg-oe-l的光降解。脂质体在ph 5.5～6.5避光照条件下，24h内ce6和ptx的释放率在52％～65％，在660nm光激发照射后，ce6和ptx的释放率在70％～80％。脂质体靶向输送ce6，通过荧光和clsm分析，表明peg-oe-l脂质体能够能够提升细胞对ce6的摄取率，和ce6在细胞内ros的产率。

27、进一步的，叶黄素、peg-oe-l、ce6的光谱吸收和叶黄素、peg-oe-l、叶黄素+ce6和peg-oe-l+ce6光降解采用紫外分光光度计表征，如图7和8.

28、进一步的，所述peg-oe-l载药脂质体(ce6+ptx/dr-lips)靶向输送ce6和ptx药物具有光和ph双响应，在ph为6.5时，其累积释药率为54％～70％。在660nm光照条件下，其累积释药率为56％～75％。

29、进一步的，ce6+ptx/dr-lips的ph和光响应性采用体外释放实验表征，如图9和10。进一步的，所制备的dr-lips、ce6+ptx/dr-lips、ph为6.5酸处理后的ce6+ptx/dr-lips、660nm激光照着后的ce6+ptx/dr-lips、660nm激光照和ph为6.5酸处理后的ce6+ptx/dr-lips的形貌采用tem拍照表征，如图11。

30、进一步的，所述peg-oe-l脂质体(dr-lips)具有良好的双响应性，在ph为6.5和660nm光照条件下，其累积释药率为65％～80％。

31、进一步，所述制备的脂质体能够增加细胞摄取率，增强药物的生物利用度。载ce6脂质体在体外显示出显著的ros产率。

32、进一步的，所述脂质体的细胞摄取率和ros产率分别采用clsm、酶标仪和荧光强度表征，如图12-15。

33、本发明的双响应脂质体(dr-lips)可以在pbs中自组装和包封药物(ptx和ce6)，以形成负载ptx和ce6的双响应脂质体(ce6+ptx/dr-lips)。在避光和660nm光照射下，对dr-lips(a)、free ce6(b)、free ptx(c)、free ptx+ptx/dr-lips(d)等脂质体进行细胞毒性分析，如图16，表明本发明的载药脂质体(ce6+ptx/dr-lips)具有很好的抗肿瘤作用。

34、本发明的技术效果和优点：

35、1.基于叶黄素光敏和原酸酯的ph的双重特性，将具有光响应和刚性结构的叶黄素和聚乙二醇亲水长链通过酸敏感基团原酸酯连接起来，首次设计了一种新型的peg-oe-l杂化聚合物，有效代替胆固醇调节脂质体膜的流动性，增加脂质体的稳定性。

36、2.基于叶黄素，通过设计含ce6光敏剂的peg-oe-l脂质体，可使peg-oe-l脂质体的光响应波长从蓝绿光区(450nm左右)提高到近红外光区(660nm左右)，明显提高响应光对细胞组织的穿透能力和灵敏度，，提高了peg-oe-l脂质体药物的靶向释放性，包载的光敏剂ce6可增加药物的释放速率，peg-oe-l脂质体作为靶向药物的光动力学治疗效果得到增强。