原位生物矿化增强纳米纤维素支架及其制备方法

本发明属于组织工程材料创制领域，具体涉及一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架及其制备方法。

背景技术：

1、纳米纤维素是从植物(如，木质纤维素，海藻等)、动物组织(如，被囊动物海鞘)中分离提取，或是由特定种属的细菌(如，木醋杆菌)代谢分泌产生的一类一维尺寸在纳米尺度的天然纤维素基材料。根据原料来源和制备方法，纳米纤维素主要分为纤维素纳米晶(cncs)，纤维素纳米纤维(cnfs)，细菌纤维素(bc)三大类。纳米纤维素具有与天然纤维素一致的化学成分，安全无毒。纤维素原料经过微纳化处理制取纳米纤维素，进一步暴露出更大比表面积和表面羟基，羧基等极性基团，赋予了纳米纤维素更为优异的生物相容性。纳米纤维素水凝胶，尤其是tempo催化氧化结合高压均质制备的纳米纤维素(tocnf和tobc)，在制备过程中易于形成高度水化润胀的三维网络环境，与人体组织细胞外基质胶原网络结构高度相似，从而为细胞黏附、生长、繁殖提供良好的3d微环境。因此，纳米纤维素，尤其是tocnf和tobc在组织工程、伤口修复、类器官培育等生物医学领域显示出巨大的潜力。

2、然而，以纳米纤维素构建组织工程材料的研究仍面临着许多问题。研究表明，组织工程支架材料的力学性能和网络结构及拓扑形貌，尤其微米至纳米级别各向异性排列的支架或基质结构微环境会直接影响细胞形态及细胞形为。支架材料的力学性能和网络结构是维持细胞显型以及诱导细胞定向分化的强有力工具。然而，当前，包括常规tocnf和tobc在内的绝大多数水凝胶，其力学性能较差，且其三维网络骨架本质上还是各向同性的无序排列结构，缺乏像肌肉、软骨、心脏瓣膜等天然组织在微观尺度上的各向异性结构和优异的生物力学性能。虽然研究人员提出可以通过添加有机/无机增强剂，或采用化学交联等手段调控纳米纤维素支架材料力学性能，但仍然存在可控范围有限，增强剂或交联剂存在潜在的细胞毒性等缺陷。且已有文献报道尚不能同时达到调控支架材料力学性能和支架网络结构，并保持良好生物相容性。因此，如何根据不同器官组织对支架材料结构和功能的需求，构建力学性能可控的纳米纤维素各向异性结构网络微环境，以满足组织工程材料在生物相容性上对结构和功能的双重要求，是纳米纤维素构建组织工程材料应用中一直以来面临的挑战。

技术实现思路

1、为了解决目前纳米纤维素基生物支架在生物医学应用中存在的上述缺陷，实现开发具有能够构建力学性能可控的纳米纤维素各向异性结构网络微环境的目标，本发明专利采用如下的技术方案：

2、原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

3、s1.用去离子水将纳米纤维素进行稀释，在真空条件下用疏水pvdf膜将纳米纤维素稀释液抽滤成膜，抽滤中真空作用力、纳米纤维表面电荷斥力和重力三者达到平衡，从而诱导纳米纤维取向排列逐层沉积成滤饼；

4、s2.抽滤至滤饼体积减少为起始滤液体积的1/50，停止抽滤，快速转移滤饼并用新的疏水pvdf膜覆盖，再将其置于吸水纸之间并压缩脱水直至干燥，期间每隔3小时更换吸水纸一次，直到滤膜与pvdf膜分离，便可得到纳米纤维素薄膜；抽滤至滤饼体积减少为起始滤液体积高于1/50，滤饼中水分含量过高，压干过程容易破坏各向异性结构；抽滤至滤饼体积减少为起始滤液体积低于1/50，纳米纤维素压干后容易粘连在pvdf膜上，不易分离；

5、s3.将步骤s2中制得的纳米纤维素薄膜浸入含有脲酶的润涨液中，使薄膜润涨并将脲酶吸入纳米纤维素水凝胶网络中，同时在纳米纤维素表面静电斥力以及表面亲水基团与水分子交互作用下，实现薄膜润涨诱导的各向异性水凝胶层状结构构建；

6、s4.将步骤s3中负载了脲酶的纳米纤维素支架用去离子水清洗以除去游离脲酶，再将上述水凝胶浸入矿化液中，完成原位生物矿化过程。

7、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，步骤s1中，纳米纤维素为tobc或tocnf；其中，所述tobc的直径为10-20nm，长度为500-1000nm，电荷密度为1.0mmol/g；所述tocnf的直径为5-10nm，长度为200-500nm，电荷密度为1.1mmol/g。

8、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，步骤s1中，用去离子水将干重50mg的tobc或tocnfs稀释至0.1wt％，随后在真空度10mbar的抽滤条件下用孔径为0.22μm，直径为47mm的疏水pvdf膜进行抽滤成膜。

9、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，步骤s2中，压缩脱水的压力为88mbar。

10、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，步骤s3中，纳米纤维素薄膜在4摄氏度条件下浸入含有脲酶的润涨液中浸入12小时，其中，润涨液中脲酶浓度为10u/ml。

11、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，所述润涨液为d-pbs，所述润涨液的浓度为0到100vol％。

12、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，步骤s4中，所述矿化液为尿素-cacl2混合溶液，尿素-cacl2混合溶液通过体积比为1：1且摩尔浓度比为0.25:1至1:0.25的尿素溶液与cacl2溶液配置而成。

13、作为一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法的优选技术方案，所述矿化液的浓度为0.1mol/l至1.1mol/l。

14、本发明的另一个发明点为：通过上述的制备方法制备出纳米纤维素支架，纳米纤维素支架横向(i)与轴向(a)的杨氏模量均存在各向异性，并且可以实现支架力学性能在10-1000kpa范围内可控。

15、本发明的有益效果是：本发明决了常规纳米纤维素支架材料力学性能较差或可控范围有限，常规化学交联增强剂存在潜在的细胞毒性等缺陷。本发明提供的原位生物矿化增强纳米纤维素各向异性支架材料力学性能的方法可以同时达到调控支架材料力学性能和支架网络结构，并保持良好生物相容性，可以满足组织工程材料在生物相容性上对结构和功能的双重要求。本发明对组织工程材料开发和纳米纤维素生物医学应用具有重要引领意义。

技术特征：

1.原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，步骤s1中，纳米纤维素为tobc或tocnf；其中，所述tobc的直径为10-20nm，长度为500-1000nm，电荷密度为1.0mmol/g；所述tocnf的直径为5-10nm，长度为200-500nm，电荷密度为1.1mmol/g。

3.根据权利要求2所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，步骤s1中，用去离子水将干重50mg的tobc或tocnfs稀释至0.1wt％，随后在真空度10mbar的抽滤条件下用孔径为0.22μm，直径为47mm的疏水pvdf膜进行抽滤成膜。

4.根据权利要求1所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，步骤s2中，压缩脱水的压力为88mbar。

5.根据权利要求1所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，步骤s3中，纳米纤维素薄膜在4摄氏度条件下浸入含有脲酶的润涨液中浸入12小时，其中，润涨液中脲酶浓度为10u/ml。

6.根据权利要求1或5所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，所述润涨液为d-pbs，所述润涨液的浓度为0到100vol％。

7.根据权利要求1所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述矿化液为尿素-cacl2混合溶液，尿素-cacl2混合溶液通过体积比为1：1且摩尔浓度比为0.25:1至1:0.25的尿素溶液与cacl2溶液配置而成。

8.根据权利要求1或7所述的原位生物矿化增强纳米纤维素支架的制备方法，其特征在于，所述矿化液的浓度为0.1mol/l至1.1mol/l。

9.基于权利要求1所述的制备方法制备出纳米纤维素支架，其特征在于，所述纳米纤维素支架呈层状取向结构。

技术总结
本发明属于组织工程材料创制领域，具体涉及一种原位生物矿化增强纳米纤维素支架及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：真空吸滤诱导纳米纤维素沉积构建纳米纤维素取向排列薄膜；溶剂润胀负载脲酶；原位生物矿化构建各向异性支架。本发明决了常规纳米纤维素支架材料力学性能较差或可控范围有限，常规化学交联增强剂存在潜在的细胞毒性等缺陷。本发明提供的原位生物矿化增强纳米纤维素各向异性支架材料力学性能的方法可以同时达到调控支架材料力学性能和支架网络结构，并保持良好生物相容性，可以满足组织工程材料在生物相容性上对结构和功能的双重要求。本发明对组织工程材料开发和纳米纤维素生物医学应用具有重要引领意义。

技术研发人员：刘俊,卢雪初,程璐,李艳,焦海鑫,张红星,傅茵怡,成亮
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15