一种负载中药的水凝胶薄膜、其制备及抗骨肉瘤的应用

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及壳聚糖/丝素蛋白负载中药冻干粉的水凝胶薄膜在治疗骨肉瘤中的应用。

背景技术：

1、骨肉瘤是青少年常见的恶性肿瘤，严重威胁青少年的生命安全和身心健康。骨肉瘤发病机制所涉及的分子过程尚不完全清楚。目前，常规的手术、化疗等治疗方法会存在复发和产生耐药性的问题。此外，手术后残留的肿瘤细胞会导致骨破坏和疾病复发。因此，有必要开发新药或增强当前使用的药物以及确定骨修复方法。药物靶向递送及手术植入骨修复材料以修复受损部位具有广泛的应用前景。壳聚糖具有优异的生物降解性和生物相容性，可用于生物工程各个领域。蚕丝蛋白是一种有机高分子材料，具备良好的韧性、成膜性及可生物降解特性，柞蚕丝素蛋白由于其分子链中具有由精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸首尾相连而成的特殊的rgd三肽肽段，该肽段对哺乳动物细胞有良好的吸附性和促增殖性。鹿茸补肾颗粒是全国名中医赵文海教授，依据天池伤科流派的骨质增生丸（“骨质增生丸”治疗增生性骨关节病）。

2、公开号cn110368485a，发明名称《鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途》公开了鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途，该鹿茸多肽可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，并且诱导骨肉瘤细胞凋亡，尤其是人骨肉瘤细胞u2os，在浓度为80μg/ml时效果最为显著。鹿茸多肽可以作为骨肉瘤治疗的潜在药物，减缓肿瘤的增长，促进治愈骨肉瘤。该专利虽然采用了鹿茸多肽治疗骨肉瘤，但是其并非中药制剂，而仅仅鹿茸众多活性成分中的一种多肽。

3、连湘倩，发表的《鹿茸活性成分调控骨肉瘤细胞死亡和迁移侵袭的机制研究》，公开了：通过网络药理学及体外细胞实验，探究鹿茸多肽及鹿茸其他活性成分调控骨肉瘤细胞死亡和迁移侵袭的作用机制。研究内容如下：（1）网络药理学分析获取鹿茸治疗骨肉瘤的物质基础和分子机制。结果发现tnf-α、notch1等可作为鹿茸治疗骨肉瘤的关键靶点；17β-雌二醇和雌酮等可作为鹿茸治疗骨肉瘤的关键成分。tnf-α介导的坏死性凋亡可促进肿瘤细胞死亡，notch1介导的notch信号通路可调控肿瘤细胞的迁移和侵袭，推测鹿茸活性成分可通过这两种途径调控骨肉瘤细胞的死亡和迁移侵袭。（2）体外细胞实验探究17β-雌二醇、雌酮及鹿茸多肽调控骨肉瘤细胞死亡的机制。mtt实验结果发现，17β-雌二醇和雌酮均可有效抑制mg63细胞的增殖活性。酶联免疫吸附实验发现，17β-雌二醇和雌酮能够上调mg63细胞中tnf-α、ripk3和mlkl蛋白的表达，tnf-α、ripk3和mlkl介导骨肉瘤细胞坏死性凋亡。说明17β-雌二醇和雌酮可以促进骨肉瘤细胞mg63中坏死性凋亡的发生。同样通过酶联免疫吸附实验发现，鹿茸多肽也可上调骨肉瘤细胞mg63中tnf-α、ripk3和mlkl的表达进而促进坏死性凋亡的发生。（3）体外细胞实验探究鹿茸多肽调控骨肉瘤细胞迁移侵袭的机制。细胞克隆形成实验结果显示，80μg/ml鹿茸多肽可以抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os的增殖能力；细胞划痕实验和transwell实验结果显示，鹿茸多肽显著抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os的迁移和侵袭能力；westernblot和qpcr实验结果显示，20μg/ml和80μg/ml鹿茸多肽处理细胞后，细胞内notch1、hes1蛋白及其mrna表达量明显下降，说明鹿茸多肽可以抑制骨肉瘤细胞mg63、u2os中notch信号通路的表达。综上，鹿茸多肽、17β-雌二醇和雌酮可通过促进坏死性凋亡的发生进而促进骨肉瘤细胞死亡，鹿茸多肽下调notch信号通路的表达从而抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。

4、目前骨肉瘤制备中的中药复方剂中，并没有涉及到含有鹿茸的中药复方剂，且在抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡的效果上表现不佳。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决中药复合方剂在治疗骨肉瘤，尤其是抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡效果不佳的问题，而提供一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜、其制备方法及在抗骨肉瘤中的应用。

2、本发明的一种负载中药的水凝胶薄膜，是由5~15重量份的鹿茸、20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补、10~30重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。

3、进一步地，所述的水凝胶薄膜是由10重量份的鹿茸、30重量份熟地黄、30重量份淫羊藿、20重量份肉苁蓉、20重量份鸡血藤、20重量份鹿衔草、20重量份骨碎补、20重量份莱菔子和壳聚糖及柞蚕丝素蛋白制成。

4、进一步地，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，采用盐酸溶解后与柞蚕丝素蛋白混合。

5、进一步地，所述的负载中药的水凝胶薄膜是将鹿茸、熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、鹿衔草、骨碎补和莱菔子制成鹿茸补肾汤冻干粉，加入到壳聚糖及柞蚕丝素蛋白的混液溶液中，得到的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液后，置于载玻片上，干燥后得到；其中，负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液中鹿茸补肾汤冻干粉的质量浓度为1.8mg/ml。

6、本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞增殖的药物。

7、本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞迁移的药物。

8、本发明的一种负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜的应用，所述的水凝胶薄膜用于制备抑制骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞坏死性凋亡或促进骨肉瘤细胞程序性凋亡的药物。

9、本发明制备所述的负载中药的水凝胶薄膜的方法如下：

10、（1）、鹿茸煎煮液：

11、称取5~15重量份的鹿茸加20倍量的水浸泡，浸泡后进行3~4次煎煮，第一次煎煮与后续每次的煎煮时间均为20~30min，其中，第一次煎煮的前10min武火煎煮，后10~20min文火煎煮；后续每次煎煮的前10min均为武火煎煮，后10~20min均为文火煎煮；煎煮后用纱布过滤；

12、（2）、称取20~40重量份熟地黄、10~30重量份淫羊藿、10~30重量份肉苁蓉、10~30重量份鸡血藤、10~30重量份鹿衔草、10~30重量份骨碎补和10~30重量份莱菔子，加6倍量的水浸泡，浸泡后进行多次煎煮，每次煎煮20~30min，前10min武火，后10~20min文火；煎煮后用纱布过滤；

13、（3）、合并滤液：将步骤（1）煎煮后的鹿茸滤液与步骤（2）的滤液合并，将合并后的滤液制得鹿茸补肾汤冻干粉；

14、（4）、将步骤（3）得到的鹿茸补肾汤冻干粉加入到壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液，充分混匀，得到负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液；

15、（5）、将负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液铺在载玻片上，室温干燥后，得到所述的负载中药的水凝胶薄膜。

16、进一步地，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的质量比为1:1，所述的壳聚糖和柞蚕丝素蛋白的混液溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，采用盐酸溶解后与柞蚕丝素蛋白混合。

17、进一步地，步骤（4）中所述的负载鹿茸补肾汤冻干粉的丝素蛋白-壳聚糖共混溶液中鹿茸补肾汤冻干粉的质量浓度为1.8mg/ml。

18、进一步地，所制得的负载中药的水凝胶薄膜置于体积百分含量为80%的乙醇中进行不溶化处理。

19、进一步地，步骤（2）中所述的浸泡后进行多次煎煮的煎煮次数为3~4次。

20、本发明改变了鹿茸补肾颗粒的传统剂型得到鹿茸补肾方，并将其制成冻干粉，已在体外试验中验证了鹿茸补肾方冻干粉具有抗骨肉瘤活性的能力，因此将三者结合制备补肾方冻干粉及负载鹿茸冻干粉水凝胶薄膜。

21、本发明的中药复方冻干粉配伍：方中以鹿茸，生精补髓，养血益阴，强筋健骨为君，臣药熟地黄与淫羊藿调补阴阳、兴肾壮骨，肉苁蓉可达入肾充髓壮骨之效，取骨碎补、鹿衔草补骨治骨、止骨痛；佐以鸡血藤配合骨碎补等诸药，在补肾益精、填髓治骨基础上，通畅经络，行气活血，即可增强健骨作用，又能达“通则不痛”之效；使以莱菔子之健胃消食理气，以防补而滋腻之弊。诸药共用，以补肾壮骨，通络止痛。

22、本发明负载中药复方冻干粉的水凝胶薄膜与《鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤的药物中的用途》相比，其提取鹿茸的有效成分，直接使用鹿茸多肽治疗骨肉瘤，而本发明所选择的鹿茸并非蛋白单体鹿茸多肽，而是直接将鹿茸与熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、鹿衔草、骨碎补、莱菔子制得中药复方冻干粉的水凝胶薄膜，而鹿茸由于未进行鹿茸多肽提取过程，因此，鹿茸多肽含量极少，并不能发挥出鹿茸多肽的功效。而本发明能够实现在抑制骨肉瘤细胞迁移，细胞增殖，改善骨肉瘤细胞的划痕愈合、促进骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和促进骨肉瘤细胞的程序性凋亡的效果显著提升，是由于本发明采用的鹿茸与熟地黄、淫羊藿调补阴阳、兴肾壮骨，以及肉苁蓉入肾充髓壮骨，骨碎补、鹿衔草补骨治骨、止骨痛，从而达到改善或延缓骨肉瘤发展，可对抑制骨肉瘤细胞迁移，影响细胞增殖。