一种常温水提野鸦椿叶片总黄酮的制备方法

本发明涉及植物成分提取，具体涉及一种常温水提野鸦椿叶片总黄酮的制备方法。

背景技术：

1、野鸦椿，属省沽油科野鸦椿属(euscaphis)，又名酒药花、花溴木、鸡眼睛。落叶灌木，分布在福建、广西、四川、云南等多地，树姿优美，冠形舒展，叶色浓绿，秋季万花调零时，叶色转红，点缀着黑色有光泽的种子和紫红色的果皮，分外美丽，观赏价值极佳，可作为园林绿化的绝佳植物种类。同时，野鸦椿是传统的中药材，其花、果、根均有药用价值，能够调节气血、缓解疼痛、消除肿胀、头晕感冒等。该植物化学成分丰富多样，已发现的化学成分主要有三萜类、酯类、酚酸类、倍半萜类等，具有抗炎、抗肿瘤、抗肝纤维化、杀(驱)虫、抑菌和抗病毒等药理活性，其提取物可用于制备降血脂和糖尿病药物中。但是，每年因自然落叶和剪枝而废弃了大量的野鸦椿叶，造成生态环境的破坏和资源的浪费。

2、黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，能够抑制或诱发某些与免疫反应、解毒、抗炎和调控细胞分裂和生殖等关键相关酶的产生。目前，植物体内黄酮类化合物的传统提取方法主要采用水+高温甚至煮沸回流；超声波+有机溶剂，如乙醇等，再结合有机溶剂，如石油醚乙酸乙酯萃取。例如，申请公布号为cn107875199a的发明专利申请“一种利用响应面法优化油橄榄叶总黄酮的提取方法”，采用的是甲醇水浴热浸提；申请公布号为cn112168873a的发明专利申请“一种利用响应面法优化平枝荀子总黄酮的提取工艺”，采用的是乙醇提取，水浴锅上50～70℃，超声提取；申请公布号为cn114288332a的发明专利申请“一种利用响应面法优化黄芪茎叶总黄酮的提取方法”，采用的是乙醇提取，40～80℃超声提取。这些方法可能导致有效成分失活和毒性较大的有机溶剂在材料和提取液中残留、造成提取的黄酮类化合物污染，在实际生产中使用过多的有机溶剂也造成环境污染，这些都会危害生物体的健康。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供一种常温水提野鸦椿总黄酮的制备方法，本发明在常温下使用纯水为提取剂、提取方法简单可行，能够有效解决由高温和有机溶剂导致的有效成分失活，同时也解决了有机溶剂的污染问题，为野鸦椿的进一步应用研究提供参考。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

2、一种常温水提野鸦椿总黄酮的制备方法，包括：

3、烘干：将野鸦椿叶放入烘箱中烘干处理，烘干温度为50-60℃；

4、粉碎：将烘干后的野鸦椿叶用粉碎机粉碎，再过100目筛网，得到野鸦椿叶粉；

5、水浸：称取所述野鸦椿叶粉，加入适量的纯水，料液比1：(20～45)g/ml，混合均匀后，置于37℃浸泡24小时；

6、超声：在超声波功率150～400w的条件下，超声20～120min；

7、离心：超声结束后，离心取上清液，冷冻干燥，制得野鸦椿总黄酮。

8、作为实施例的优选方式，所述烘干步骤中，烘干温度为55℃。

9、作为实施例的优选方式，所述水浸步骤中，料液比为1：40g/ml。

10、作为实施例的优选方式，所述超声步骤中，所述超声波功率为305w。

11、作为实施例的优选方式，所述超声步骤中，超声时间为100min。

12、本发明首次采用纯水常温浸提技术，从野鸦椿叶中提取总黄酮，方法简单，操作容易，减少高温和有机溶剂对有效成分的破坏、无有机溶剂的污染，具有实际生产的价值。

13、本发明还提供了一种基于响应面法优化常温水提野鸦椿叶总黄酮的提取方法，包括：以下步骤：

14、s1、野鸦椿叶的预处理

15、将野鸦椿叶置于烘箱中并在55℃条件下烘干，将烘干后经粉碎机粉碎后过100目标准筛，将得到的野鸦椿叶粉保存备用；

16、s2、供试样品提取液的制备

17、称取1.0g的野鸦椿叶粉，轻轻倒入50.0ml锥形烧瓶中，加入适量的纯水，混合均匀后置于37℃浸泡24小时；在设定的超声波功率下，对样品进行一段时间处理，然后将样品冷却至室温；之后进行离心，用50.0ml容量瓶收集上清液，取0.2ml提取液，移于2.0ml离心管中，测定其吸光值；

18、s3、对照品系列标准曲线溶液的配制

19、称取芦丁0.01g，以60％乙醇溶液5ml定容，制成浓度为2mg/ml的芦丁标准溶液；用60％乙醇溶液对该浓度溶液进行稀释至0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mg/ml备用；然后按照试剂盒《植物类黄酮含量检测试剂盒比色法》(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：d799279-0050)的说明书进行操作，以60％乙醇溶液300ul定容，混匀后在37℃水浴中浸泡45min，从而得到系列标准曲线溶液；

20、s4、测定波长的确定及标准曲线的绘制

21、以60％乙醇溶液参照，采用分光光度法对最大浓度的标准曲线溶液进行试验，从波长200～600nm中测出最大吸收波长为470nm，以此为测定波长；在该条件下，测出系列标准曲线溶液的吸光值，绘制标准曲线并计算出回归方程；

22、标准曲线的回归方程为：

23、y＝0.1597x-0.0004；相关系数r2＝0.9987；

24、s5、样品检测

25、取样品提取液0.20ml，对应标准曲线溶液的操作步骤，配制出样品待测液；在470nm波长下测定吸收值，样品浓度由标准曲线回归方程计算出，最后由黄酮提取率计算公式得出野鸦椿待测液的黄酮提取率；

26、s6、单因素试验

27、通过三个单因素试验，研究野鸦椿叶黄酮提取率受三个因素的影响效果，从而确定响应面试验设计的三个水平；

28、s61、液固比：称取1.0g粉，分别加入20、25、30、35、40或45ml的纯水，混匀后置于37℃浸泡24小时，超声波功率为200w，时间设为20min，计算出黄酮提取率；

29、s62、超声波功率：设置液固比为35ml/g，分别在超声波功率150、200、250、300、350或400w的条件下超声20min，计算出黄酮提取率；

30、s63、超声处理时间：设置液固比为35ml/g，在超声波功率300w的条件下，分别超声20、40、60、80、100或120min，计算出黄酮提取率；

31、在470nm的测定波长下，测出不同条件下各样品溶液的吸光值，由芦丁标准曲线的回归方程式，计算出各样品溶液的浓度，再通过下列公式算出野鸦椿叶的黄酮提取率：

32、黄酮提取率(％)＝c×v/w×100％

33、式中，c为样品黄酮质量浓度，v为样品提取液体积，w为野鸦椿叶样品质量；

34、s7、响应面试验

35、在单因素试验结果的基础上，利用软件design-expert 11对响应面法优化结果进行拟合，以黄酮提取率为响应值，液固比、超声波功率、超声波时间为自变量；得出野鸦椿叶黄酮提取率(y)对料液比(a)、超声波功率(b)、超声波处理时间(c)的回归模型方程；

36、s8、验证试验

37、根据design-expert 11的优化拟合，确定超声波辅助提取野鸦椿叶中黄酮的最佳工艺参数；

38、s9、统计分析

39、使用excel 2017处理试验数据进行统计分析。

40、作为实施例的优选方式，所述回归模型方程：

41、y＝1.91+0.06555a+0.0313b-0.0267c-0.0065ab+0.0395ac-0.0085bc-0.0547a2-0.1092b2-0.0681c2。

42、作为实施例的优选方式，所述最佳工艺参数为：液固比40.00ml/g、超声波功率305w、超声波处理时间100min。