硫唑嘌呤双响应型结肠靶向纳米递送系统及其制备方法和应用

本发明属于医药生物领域，涉及硫唑嘌呤双响应型结肠靶向纳米递送系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、硫唑嘌呤(azathiopurine，aza)是一种嘌呤类似物免疫抑制剂，可以维持cd和uc的长期缓解、促进黏膜愈合、预防cd患者术后复发、提高生物制剂提高临床疗效、有效减少激素依赖等。但是，aza对炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)的治疗也表现出不可忽视的局限性。首先，治疗效果存在很大的个体差异，表现为约2/3的患者能诱导缓解，约1/3的患者在治疗过程中复发，15％患者完全无效。其次，治疗剂量下副作用比较明显。据报道，约有9-28％的患者在治疗过程中因药物副作用不能耐受而停药。导致停药的主要副作用包括两大类：第一类是非过敏反应，主要为骨髓抑制和肝脏毒性，与aza在细胞内的代谢产物浓度密切相关；第二类是过敏反应，包括皮肤潮红、发热、关节痛、恶心、呕吐、腹痛、胰腺炎和药物性肝炎等，主要是由于aza普通制剂全消化道吸收入血、结肠靶向性差引起的。增加结肠靶向性/降低全身吸收是降低aza非过敏性不良反应的途径之一。

2、结肠靶向给药系统(colontargeted drug delivery system,ctdds)是一种利用制剂学手段使药物在上消化道不释药，传递到盲肠或结肠部位后开始崩解释药，从而靶向增加病变局部药物浓度，发挥局部治疗作用，同时降低药物不良反应的第四代新型给药技术。近年来，随着ctdds的飞速发展，多种给药系统出现，多种靶向性材料已被尝试应用。目前正在研究的aza的ctdds包括采用甲基丙烯酸酯聚羟基链烷酸酯三元共聚物

3、(phbvhhx)、壳聚糖等聚合物制备的基于ph敏感机制的结肠靶向片剂等。相比于普通剂型，这些在研的靶向剂型可在一定程度上增加aza在结肠部位的聚集。而且根据文献报道，结肠的肠道微生物能够代谢嘌呤类免疫抑制剂，增加溃疡部位的活性产物硫鸟嘌呤核苷酸(thioguanine nucleotides,tgns)的浓度，达到治疗ibd的效果，结肠靶向的制剂可通过微生物异种代谢的作用减少aza全身分布，进而减少不良反应。然而，尽管ph敏感聚合物可以控制药物在胃部不释放，但回肠、盲肠和升结肠连接部位的ph值变化都使得单一靠ph聚合物控制药物的ctdds结肠靶向性不佳，且容易受个体差异和病理因素影响，难以真正实现aza在结肠部位的精准控释。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种硫唑嘌呤型结肠靶向纳米递送系统。

2、本发明所述的递送系统包括以下三种：微生物响应型aza@z/pnps，ph响应型aza@enps，双响应型aza@z/p-enps。

3、本发明所述的微生物响应型aza@z/pnps，由以下方法制备得到：

4、(1)水相：2～5ml，浓度为0.3～2mg/ml果胶pt的水溶液；

5、油相：0.4～2ml，浓度为10～50mg/ml玉米醇溶蛋白zein的乙醇水溶液(60％～95％，v/v)，并加入10～60μl 75mg/ml aza的氨水溶液；

6、(2)将油相逐滴滴加至水相中，同时以200～1200rpm搅拌10～60min，搅拌均匀；

7、(3)将上述乳液通过旋转蒸发除去有机试剂，得到纳米溶液；

8、(4)将上述纳米溶液以1000～4000rpm的转速离心10～30min以去除不溶性颗粒，得到最终的aza@z/pnps纳米制剂。

9、优选的，微生物响应型aza@z/pnps的制备方法：

10、将30mg zein溶解在1ml乙醇水溶液(80％,v/v)，加入3mg aza(40μl氨水)，将溶液用移液枪缓慢注入2.5ml pt溶液(1mg/ml)中，同时以600rpm搅拌20min，40℃旋蒸除去乙醇，随后以3,000rpm的转速离心10min以去除不溶性颗粒，即得。

11、本发明所述的ph响应型aza@enps，由以下方法制备得到：

12、(1)水相：2～5ml、0.1～1％ f68的水溶液

13、油相：0.4～2ml、10～50mg/ml es100的丙酮溶液，并加入10～60μl 75mg/ml aza的氨水溶液；

14、(2)将油相逐滴滴加至水相中，同时以200～1200rpm搅拌10～60min，搅拌均匀；

15、(3)将上述乳液通过旋转蒸发除去有机试剂，得到纳米溶液；

16、(4)将上述纳米溶液以1000～4000rpm的转速离心10～30min以去除不溶性颗粒，得到aza@enps纳米制剂。

17、优选的，本发明所述的ph响应型aza@enps的制备方法：

18、将30mg es100溶解在1ml丙酮溶液，加入aza 3mg(40μl氨水)，将溶液用移液枪缓慢注入2.5ml f68溶液(0.5％)中，同时以600rpm搅拌20min，40℃旋蒸除去乙醇，随后以3,000rpm的转速离心10min以去除不溶性颗粒，即得。

19、本发明所述的双响应型aza@z/p-enps，由以下方法制备得到：

20、(1)水相：1～2.5ml、0.3～2mg/ml pt的水溶液，1～2.5ml 0.1～1％ f68的水溶液；

21、油相：0.2～1ml、10～50mg/ml zein的乙醇水溶液(60％～95％，v/v)，0.2～1ml10～50mg/ml es100的丙酮溶液，并加入10～60μl 75mg/ml aza的氨水溶液；

22、(2)将油相逐滴滴加至水相中，同时以200～1200rpm搅拌10～60min，搅拌均匀；

23、(3)将上述乳液通过旋转蒸发除去有机试剂，得到纳米溶液；

24、(4)将上述纳米溶液以1000～4000rpm的转速离心10～30min以去除不溶性颗粒，得到最终的aza@z/p-enps纳米制剂。

25、优选的，本发明所述的双响应型aza@z/p-enps的制备方法：

26、取zein(30mg/ml，80％乙醇)0.5ml，加入aza 3mg(40μl氨水)混合均匀后，加入es100(30mg/ml，丙酮)0.5ml，搅拌下用移液枪滴加到pt 1mg/ml1.25ml和0.5％ f681.25ml的混合溶液中(有机相/水相，2：5，v/v)，混合液在600rpm下搅拌20min，40℃旋蒸除去乙醇，随后以3,000rpm的转速离心10min以去除不溶性颗粒，即得。

27、其中，zein(30mg/ml，80％乙醇)0.5ml：括号的内容可能会存在不清楚的问题，请给出进一步解释，如何制备得到的：例如：将浓度为30mg/ml加入到0.5ml浓度为80％乙醇中，即得。

28、其中，zein(30mg/ml，80％乙醇)0.5ml：将15mg zein加入到0.5ml浓度为80％的乙醇水溶液中，即得。

29、其中，aza 3mg(40μl氨水)：将3mg aza加入到40μl氨水中，即得。

30、其中，es100(30mg/ml，丙酮)0.5ml：将15mg es100加入到0.5ml丙酮中，即得。

31、其中，搅拌下用移液枪滴加到pt 1mg/ml 1.25ml和0.5％ f68 1.25ml的混合溶液中(有机相/水相，2：5，v/v)：将1.25mg pt加入到1.25ml水中，即得1mg/ml的pt水溶液，将2.5mg f68加入到1.25ml水中，即得0.5％的f68水溶液，将二者混合，得到2.5ml的混合溶液作为水相，该水相与前述有机相的体积比为2：5。

32、本发明所述的递送系统，可以制备成任何剂型的药用制剂。

33、本发明所述的递送系统可以制备成纳米制剂。

34、药用的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、粉针剂、栓剂、霜剂、滴剂或贴剂。其中，所述片剂为糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂或缓释片剂；所述胶囊剂为硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂；所述粉针剂为冻干粉针剂。

35、为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊或装在小管或小瓶中的粉剂，或装在管或瓶中的软膏、凝胶或霜剂。

36、本发明所述的递送系统在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

37、本发明所述的微生物响应型aza@z/pnps纳米制剂在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

38、本发明所述的ph响应型aza@enps在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

39、本发明所述的双响应型aza@z/p-enps在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

40、本发明为了降低aza非过敏性不良反应，可以通过增加结肠靶向性/降低全身吸收的方式，近年来，少量研究开始报道利用ph敏感型的ctdds来控制aza在结肠定位释放，以减少其全身暴露。ph敏感型的ctdds基于ph敏感聚合物制成，利用消化道内不同部位的ph值的差异来实现药物控释：通常在低ph条件下不溶解，当ph值增加时，ph敏感聚合物溶解性急剧增加而将药物释放。目前正在研究的aza的ctdds包括采用甲基丙烯酸酯聚羟基链烷酸酯三元共聚物(phbvhhx)、壳聚糖等聚合物制备的结肠靶向片剂等。相比于普通片剂，其可以在一定程度上增加aza在结肠部位的蓄积，提高治疗效果的同时减少全身毒副反应。然而，目前报道的基于单一ph敏感释药机制的给药系统均无法实现aza在结肠部位的精准控释。单纯的ph依赖型受个体差异和病理因素影响，不易于实现靶向释放药物。其机理在于：尽管ph敏感聚合物可以控制药物在胃部不释放，但普遍在小肠的远端即开始释放药物，故结肠靶向较差。此外，回肠、盲肠和升结肠连接部位的ph值变化都使得单一靠ph聚合物控制药物的ctdds靶向性不佳。通过系统文献分析及探索研究，我们发现：复合型ctdds有可能克服单一靶向给药系统的局限性。在多种结肠靶向的技术(如ph依赖型、时间依赖型、前药等)中，微生物控制型的ctdds是近些年新兴的一种靶向结肠技术。结肠内存在大量微生物，主要包括厌氧菌，如拟杆菌属、双歧杆菌、梭状芽胞杆菌、肠球菌、肠杆菌、瘤胃球菌属等，这些菌群可以产生大量的酶，如葡萄糖醛酸、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、硝基还原酶、偶氮还原酶、脱氨酶、脱羟基酶等。由于多种特异性生物降解酶的存在，使得与其他结肠靶向技术相比，用生物可降解聚合物材料制备的释药系统显示出更好的结肠靶向性。这种给药系统在到达结肠后，聚合物材料被结肠肠道菌群生物降解为小片段或聚合物骨架，分子量减小、机械强度变小而释药。但是，如果单一用微生物型ctdds，也存在聚合物材料在不同ph值的环境下发生溶胀，导致药物过早释放的风险。因此我们将ph依赖型与微生物控制型两项技术有机融合，开发出一种ph-微生物双响应型结肠靶向释药系统，则一方面可以在药物载体通过上消化道时保证其完整性，避免药物被酶降解和药物相互作用，减少药物对胃部的刺激，另一方面又能最大限度地确保药物在富含微生物菌群的肠段被释放，提高结肠靶向性。另外，我们亦希望通过该释药系统中的辅料有效调节肠道微生物紊乱，促进ibd的治疗。

41、为此，本发明选用ph敏感材料(es100)，以及酶敏感材料果胶(pt)和安全性物材料玉米蛋白(zein)对aza进行包载，制备出了一种递送aza的ph-微生物双响应型结肠靶向释药系统(aza@z/p-enps)，一方面可以保证药物载体较为完整的通过上消化道，避免aza被酶降解和药物相互作用，减少药物对胃部的刺激，另一方面又能最大限度地确保aza在富含微生物菌群的肠段被释放，提高结肠靶向性。

42、体内过程：aza@z/p-enps口服后，首先在结肠ph环境下es100外壳溶解，随后在微生物果胶酶作用下，pt解聚，释放出辅料和药物aza，pt具有调节肠道微生物，保持肠道屏障功能的作用；aza可以通过肠道微生物的代谢，产生活性代谢产物。

43、本发明构建的载aza的ph-微生物双响应型结肠靶向释药系统联合利用ph和结肠微生物两种控释机制的优势，相比单ph/微生物敏感的制剂可最大限度地确保药物在富含微生物菌群的肠段被释放，提高结肠靶向性。

44、除此之外，该释药系统可通过多种机制协同治疗ibd，共同发挥增效减毒的作用，首先，针对ibd的肠道微生物紊乱，选用同时具有肠道微生物敏感性、可调节肠道微生物的生物相容性材料——果胶来构建结肠靶向纳米粒，通过精准释放aza和调控肠道微生物治疗ibd；其次充分利用肠道微生物对嘌呤类药物的代谢优势，进一步增加结肠炎症部位aza活性代谢产物的浓度。

45、对于说明书中出现的术语和英文缩写，作进一步的解释、说明：

46、