通过设计和改造二硫键交联位点的SLC膜蛋白复合物的制备方法

本申请属于蛋白质结构领域，具体涉及一种通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法。

背景技术：

1、转运蛋白是人体内最大的膜蛋白家族，包含多种转运方式，其中溶质载体蛋白(slc)家族最大的类别，共有456个成员，在外源和内源分子的吸收、分布和排泄等生物过程中起着至关重要的作用。目前，转运蛋白是主要的药物靶点，占现阶段已知药物靶点的60％以上，以转运蛋白为靶点的创新药物研发一直是医药领域的研究热点。

2、而蛋白质结构的解析是药物设计的关键。单颗粒分析(single particleanalysis,spa)作为冷冻电镜技术之一，能观察靶点-药物的结合复合物高分辨率结构，以及它们的相互作用。从指导设计苗头化合物到先导化合物，以及助力药物研发其他关键步骤，这种基于结构的药物设计方法(sbdd)，能为药物设计和筛选提供必要结构信息；spa近于原子级别的结构分析可以提高药物的特异性，从而开发出更有效、副作用更小的药物。在现代药物研发过程中，确定蛋白-小分子复合物的高分辨结构，可以加速小分子抑制剂的筛选，减少需要合成和验证的化合物数量，从而实现以更少的迭代次数高效推进候选药物的筛选。

3、但针对转运蛋白的靶点筛选及药物开发仍面临巨大的挑战。这些膜蛋白及其复合物的复杂性使得它们难以进行有效的表达和纯化。此外，它们通常无法通过传统的质谱法进行直接检测，尤其是那些分子量较小(小于85kda)且缺乏稳定可溶结构域的转运蛋白。这些问题给结构生物学领域的数据处理带来了重要的技术挑战。

4、通常情况下，通过筛选与转运蛋白结合的高质量、高特异性抗体，形成抗体-蛋白复合物，可以帮助解析转运蛋白的结构，进一步理解其功能和机制。然而，目前仅有少数slc家族成员的转运蛋白适用于高质量抗体的筛选。由于slc家族转运蛋白之间的结构和序列相似性较高，抗体可能出现交叉反应，难以区分不同同源蛋白。其次，转运蛋白主要存在于细胞膜或细胞器膜上，使获得具有在足够亲和力和特异性的抗体变得更具挑战性，因为抗体需要克服细胞膜上的障碍并实现良好的结合。此外，slc家族转运蛋白的结构复杂性，包括多个跨膜结构与和可变的构象，降低了准确识别特定结构域和抗体结合位点的可行性。截至目前，人类蛋白质图谱仅报道了45种slc家族成员的抗体，这意味着抗体筛选在转运蛋白中面临着高亲和力和高特异性的挑战性问题，并且更加复杂。

5、传统技术中共识突变是一种利用多个相关蛋白序列中高度保守的氨基酸残基来改变目标蛋白序列的方法。其基本假设是，这些保守残基在蛋白质结构和功能中发挥重要作用，因此通过引入它们可以增强蛋白质的结构稳定性。然而，共识突变的效果受到多个技术问题的限制。

6、首先，蛋白质的结构复杂性导致蛋白质的稳定性受到多种相互作用的影响，包括但不限于氢键、疏水相互作用、二硫键和离子相互作用等，不仅仅由保守残基决定。其次，蛋白质结构和折叠动力学也限制了共识突变的效果；最后，蛋白序列的多样性：可用于共识突变的相关蛋白序列可能有限，这限制了选择和效果。因此，仅依靠共识突变来提高整个蛋白质的稳定性是具有一定困难的。

7、综上所述，本领域亟需要一种增强slc膜蛋白复合物结构稳定性的制备方法，帮助slc家族蛋白的冷冻电镜的结构解析，并应用在基于冷冻电镜结构的slc家族蛋白药物筛选。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供一种slc膜蛋白复合物的制备方法帮助slc家族蛋白的冷冻电镜的结构解析，并提升整个蛋白质结构的稳定性。

2、本申请一方面提供一种slc膜蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：

3、根据目标蛋白1和目标蛋白2的结构预测信息，参照slc膜蛋白复合物三维结构进行拟合，生成所述目标蛋白1和所述目标蛋白2的复合物的预测模型。

4、根据所述复合物的预测模型确定所述目标蛋白1和目标蛋白2之间可能形成二硫键的位点，从位点中选出空间距离小于的位点作为改造位点。

5、将所述目标蛋白1和所述目标蛋白2中的改造位点的氨基酸突变为半胱氨酸，分别形成目标蛋白1’和目标蛋白2’，目标蛋白1’和目标蛋白2’通过二硫键连接，制备slc膜蛋白复合物。

6、在其中一个实施例中，若存在多个空间距离小于的位点，选取空间距离相对较小的位点作为改造位点。

7、在其中一个实施例中，所述slc膜蛋白选自slc3a2、slc7a5、slc7a6、slc7a7、slc7a8、slc7a10和slc7a11中的至少两种。

8、在其中一个实施例中，采用pymol、ucsf chimera或ucsf chimerax测量所述位点之间的空间距离。

9、在其中一个实施例中，slc膜蛋白复合物的制备方法还包括构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体，导入细胞表达与纯化后收集slc膜蛋白复合物。

10、在其中一个实施例中，利用同源重组系统构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体。

11、可选地，所述表达载体含有twin-strep标签。

12、在其中一个实施例中，构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体包括将突变后的半胱氨酸的氨基端序列插入至带有twin-strep标签的哺乳动物表达载体中。

13、可选地，所述表达载体选自pcdna-slc3a2-k300c-twin-strep、pcdna-slc7a11-q219c-twin-strep、pcdna-slc3a2-k533c-twin-strep或pcdna-slc7a5-e303c-twin-strep。

14、在其中一个实施例中，收集slc膜蛋白复合物之前包括去垢剂置换的步骤。

15、在其中一个实施例中，收集slc膜蛋白复合物之前还包括凝胶过滤色谱验证。

16、本申请另一方面还提供所述的方法制得的slc膜蛋白复合物在基于冷冻电镜结构的slc家族蛋白药物筛选中的应用。

17、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

18、本申请提供的slc膜蛋白复合物的制备方法，通过预测选取突变后半胱氨酸空间距离小于的slc膜蛋白进行氨基酸位点突变，突变后的slc膜蛋白直接可以形成稳定的二硫键。采用本申请slc膜蛋白复合物的制备方法得到的slc膜蛋白复合物能够稳定存在于溶液中且具备生理活性，蛋白产量显著提升，在冷冻电镜下膜蛋白颗粒均一性好，无明显取向优势，符合作为冷冻电镜样品进行高分辨结构解析的需求。

19、其次，通过本申请的slc膜蛋白复合物的制备方法制备得到的slc膜蛋白复合物有助于slc家族蛋白在冷冻电镜下的高分辨结构解析。通过结构解析，可以获取氨基酸底物与slc膜蛋白复合物结合口袋的结构信息，以及与周围氨基酸残基的相互作用信息。这些结构信息可以进一步应用在基于冷冻电镜结构的slc家族蛋白药物筛选中。

技术特征：

1.slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，若存在多个空间距离小于的位点，选取空间距离相对较小的位点作为改造位点。

3.根据权利要求1所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述slc膜蛋白选自slc3a2、slc7a5、slc7a6、slc7a7、slc7a8、slc7a10和slc7a11中的至少两种。

4.根据权利要求1～3任一项所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，采用pymol、ucsf chimera或ucsf chimerax测量所述位点之间的空间距离。

5.根据权利要求1～3任一项所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，还包括构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体，导入细胞表达与纯化后收集slc膜蛋白复合物。

6.根据权利要求5所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，利用同源重组系统构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体；

7.根据权利要求1～3或6中任一项所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，构建含有突变后的slc膜蛋白表达载体包括将突变后的半胱氨酸的氨基端序列插入至带有twin-strep标签的哺乳动物表达载体中；

8.根据权利要求1～3或6中任一项所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，收集slc膜蛋白复合物之前包括去垢剂置换的步骤。

9.根据权利要求1～3或6中任一项所述的slc膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，收集slc膜蛋白复合物之前还包括凝胶过滤色谱验证。

10.权利要求1～9任一项所述的方法制得的slc膜蛋白复合物在基于冷冻电镜结构的slc家族蛋白药物筛选中的应用。

技术总结
本申请提供的SLC膜蛋白复合物的制备方法，通过预测选取突变后半胱氨酸空间距离小于的SLC膜蛋白进行氨基酸位点突变，突变后的SLC膜蛋白直接可以形成稳定的二硫键。采用本申请SLC膜蛋白复合物的制备方法得到的SLC膜蛋白复合物能够稳定存在于溶液中且具备生理活性，蛋白产量显著提升，在冷冻电镜下膜蛋白颗粒均一性好，符合作为冷冻电镜样品进行高分辨结构解析的需求。其次，通过本申请的SLC膜蛋白复合物的制备方法制备得到的SLC膜蛋白复合物有助于SLC家族蛋白在冷冻电镜下的高分辨结构解析。可以获取氨基酸底物与SLC膜蛋白结合口袋的结构信息，以及与周围氨基酸残基的相互作用信息。这些信息进一步应用在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中。

技术研发人员：何俊,官嘉丽,陈盈盈,邹彬倩
受保护的技术使用者：中国科学院广州生物医药与健康研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15