一种具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物发酵及化妆品应用，具体而言，涉及一种具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物及其应用。

背景技术：

1、人类皮肤每天暴露于太阳紫外线(uv)辐射中。阳光中的紫外线根据其波长划分主要包括3种类型，长波紫外线(uva，波长为320～400nm)、中波紫外线(uvb，波长为290～320nm)和短波紫外线(uvc，波长为200～290nm)。波长短于290nm的uvc被臭氧层阻挡；uva具有极强的穿透能力，能影响皮肤真皮甚至皮下组织区域，导致氧化应激和组织炎症；uvb可直接与dna相互作用产生二嘧啶光产物，导致dna复制过程中的dna损伤。急性紫外线辐射会导致皮肤晒伤、异常色素沉着和免疫抑制，长期暴露与紫外线(uv)下导致皮肤过早老化即皮肤光老化。研究表明光老化发生主要与活性氧自由基(ros)相关，包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。人体正常生理代谢和环境影响如紫外线照射、环境污染等都会导致ros的产生。过量的ros水平产生氧化应激，其造成的氧化损伤主要包括对细胞组分的损伤，如细胞膜、dna、脂质或蛋白质如通过诱导基质蛋白金属酶(mmps)的合成，mmps降解ecm中的胶原蛋白和弹性蛋白，并且抑制胶原蛋白和弹性蛋白的合成。此外，ros可通过激活核因子-κb(nf-κb)，从而影响白细胞介素-1(il-1)、表皮生长因子(egf)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等促炎细胞因子的表达来促进炎症反应的发生。氧化应激进一步导致如表皮层中角质形成细胞活力降低，更新减慢、屏障功能减弱，导致皮肤干燥、脱屑等；真皮层中成纤维细胞的数量逐渐减少，胶原合成减慢，分解加速。因此光老化的皮肤表现为粗糙、松弛、深皱纹、毛细血管扩张泛红和色素沉着暗沉等。基于以上，如何预防皮肤光氧化或缓解皮肤的紫外线损伤，延缓皮肤光老化一直受到人们的极大关注。抗氧化是抵御皮肤衰老的至关重要的途径。由于各种安全和效率问题，大多数传统的防晒剂和增白剂等可以吸收部分紫外线，但是其并不能完全满足化妆品应用如改善皮肤光老化的需要。

2、目前，一些天然发酵物其含有的组分如维生素、氨基酸、多肽、矿物质、多糖、黄酮、多酚等具有一定的抗氧化功效，其安全性更高、功能性更突出以及生物相容性好等优点逐渐成为人们开发和研究的热点。如授权公告号为cn101724006a的中国发明专利公开了一种丝状酵母样真菌发酵产物的制备方法，采用丝状酵母样真菌和松茸、白柳树皮、灵芝、白松露或大米制备的纯天然物培养基进行多重发酵，提高细胞安全性、提高发酵产物护肤功效，节约成本，适用于生产制造，主要应用于保湿、控油、提亮肤色等美容护肤产品中，但未涉及抗光老化等功效的用途。

3、抗衰经典成分之一的多肽被广泛应用在化妆品、美容护肤领域，然而也存在一定的应用痛点，一方面其渗透性低，实际进入皮肤中发挥作用的量受限，另一方面，大部分多肽类会在血液以及皮肤组织中被蛋白酶降解失活，失去功效性，因此多肽类原料的生物利用度很低，无法最大可能发挥其功效性。近年来，科学家证实环肽(或环状肽)具有体内半衰期长、结构较稳定和渗透性强等特点，因此，外用含环肽产品能够起到一定的护理和防御、减缓衰老的效果，开发环肽在美容护肤领域中应用也具有一定的创新性及实用性。中国发明专利cn116162135a公开了一种环六肽及其应用，对其进行功效研究发现在皮肤抗皱和紧致方面都具有比线性肽更加杰出的功效，主要应用于化妆品及医美紧致抗皱等领域中，但未涉及抗光老化、抗氧化及舒缓修复等功效的应用。

4、因此，急需找到一种具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物，通过筛选发酵产物与环六肽，复配出一种组合物，进而实现能显著提升抗皮肤光老化、修复光损伤或抗衰祛皱，同时还可显著提升胶原蛋白含量，具有抑制mmp-1、舒缓修护、缓解氧化应激、抑制炎症因子或炎性介质的功效。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物及其应用。通过筛选复配不同的丝状酵母样真菌发酵产物和环六肽、限定两者的相对含量，最终得到一组具有优越渗透性、更高更全功效的丝状酵母样真菌发酵组合物，具有显著减少自由基的产生、抑制基质金属蛋白酶的合成、防护紫外线的损伤、减少细胞凋亡、防止光老化等功效，其在美容护肤及医美抗衰领域具有更强的应用潜能。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下方案实现：

3、一方面，本发明提供一种组合物，包括丝状酵母样真菌发酵产物和环六肽。

4、在一些实施方式中，所述丝状酵母样真菌发酵物中内含有丰富氨基酸、多肽等，可直接供给皮肤细胞营养物质，优选比例后，更可以协同环肽促进角质形成细胞及成纤维细胞的增殖能力，活化细胞，提供了其功效性实现的基础。

5、进一步地，所述组合物中，按质量百分比计，包括0.05％～90％丝状酵母样真菌发酵产物，0.05％～5％环六肽，余量为基础组分，以上组分质量百分比之和为100％。

6、进一步地，所述环六肽的序列为cyclo(gln-gly-pro-gln-gly-pro)。

7、在一些实施方式中，使用最佳制备方法制备得到高纯度的环六肽，与丝状酵母样真菌发酵产物复配得到的组合物，具有显著协同增效能力，具有更好的美容护肤功效。

8、进一步地，所述丝状酵母样真菌发酵产物的制备方法为：采用丝状酵母样真菌galactomyces citri-aurantii进行多重发酵，即前一次发酵结束离心得到的沉淀物在灭菌后被用于后一次发酵的培养基成分，所述多重发酵的发酵次数为4次，包括以下步骤：

9、(1)培养丝状酵母样真菌，获得接种液；

10、(2)将接种液接种到液体天然物培养基进行首次发酵；

11、(3)收集每次发酵结束时离心产生的上清液，混合后即作为发酵产物；

12、所述天然物培养基中，所述天然物包括大米、白柳树皮、灵芝、白松露、松茸或白桦茸中的任意一种；当天然物为大米时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌大米发酵产物；当天然物为白柳树皮时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物；当天然物为灵芝时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌灵芝发酵产物；当天然物为白松露时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌白松露发酵产物；当天然物为松茸时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌松茸发酵产物；当天然物为白桦茸时，所述丝状酵母样真菌发酵产物为丝状酵母样真菌白桦茸发酵产物。

13、在一些实施方式中，使用4重发酵技术制备得到丝状酵母样真菌发酵产物，相比于其他次数的多重发酵的发酵产物，其安全性最高，护肤功效最好。该类发酵产物具有更高的蛋白含量水平，更好的护肤功效，其发酵产物滤液具有更高的细胞安全浓度范围。

14、优选地，所述组合物中，按质量百分比计，包括丝状酵母样真菌大米发酵产物0.05％～10％，或丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物0.05％～15％，或丝状酵母样真菌灵芝发酵产物0.05％～7.5％，或丝状酵母样真菌白松露发酵产物0.05％～10％，或丝状酵母样真菌松茸发酵产物0.05％～10％，或丝状酵母样真菌白桦茸发酵产物0.05％～15％。

15、在一些实施方式中，对组合物中发酵产物和环六肽的安全浓度分别进行了筛选，实验结果表明，在大米发酵产物为0.05％～10％、白柳树皮发酵产物为0.05％～15％、灵芝发酵产物为0.05％～7.5％、白松露发酵产物为0.05％～10％松茸发酵产物为0.05％～10％、白桦茸发酵产物为0.05％～15％或环六肽为0.05％～5％的范围内，细胞存活率均可以达到70％以上，同时，在原有发酵液的基础上复配高浓度肽，不改变对细胞的安全耐受度，具有极强的应用价值，相比于市售酵母菌发酵产物，本发明的丝状酵母样真菌发酵产物组合物细胞耐受度更高，生物相容性更好。优选地，组合2(白柳树皮发酵液+环六肽)和组合6(白桦茸发酵液+环六肽)在安全性为基础的前提下可使用的浓度更高，表明其生物毒性低，安全性高，可在更高浓度下使用，同时在浓度更高的情况下，组合物所产生的效果越显著。

16、优选地，所述组合物中，按质量百分比计，包括丝状酵母样真菌大米发酵产物2.5％，或丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物2.5％，或丝状酵母样真菌灵芝发酵产物2.5％，或丝状酵母样真菌白松露发酵产物2.5％，或丝状酵母样真菌松茸发酵产物2.5％，或丝状酵母样真菌白桦茸发酵产物2.5％；还包括环六肽为2％。

17、另一方面，本发明提供一种组合物用于制备抗皮肤光老化或修复光损伤或提高渗透能力的制剂的用途，所述组合物包括丝状酵母样真菌大米发酵产物、丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物、丝状酵母样真菌灵芝发酵产物、丝状酵母样真菌白松露发酵产物、丝状酵母样真菌松茸发酵产物、丝状酵母样真菌白桦茸发酵产物中的任意一种和环六肽。

18、在一些实施方式中，在最佳比例下(发酵产物为2.5％、环六肽为2％)，复配丝状酵母样真菌发酵产物均可达到促进环六肽透皮吸收的效果，且当优选白柳树皮发酵产物+环六肽组合时，渗透效果达到最佳。

19、进一步地，所述组合物包括丝状酵母样真菌大米发酵产物和环六肽，所述环六肽的序列为cyclo(gln-gly-pro-gln-gly-pro)。

20、在一些实施方式中，对丝状酵母样真菌发酵产物组合物的光损伤修复能力进行测试，实验结果表明，丝状酵母样真菌发酵产物组合物中，当丝状酵母样真菌发酵产物浓度为0.1％～10％和环六肽浓度为0.5～3％时，具有显著的光损伤修复能力，同时略有促进细胞活性的作用，且当发酵产物为2.5％、环六肽为2％时，其光损伤修复能力达到最强；同时，当优选组合1(大米发酵液+环六肽)时，达到最佳抗皮肤光老化、光损伤修复能力和促进细胞活性的作用，具有极强的应用价值。

21、再一方面，本发明提供一种组合物用于制备提升舒缓修护能力、抑制炎症因子或炎性介质的制剂的用途，所述组合物包括丝状酵母样真菌大米发酵产物、丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物、丝状酵母样真菌灵芝发酵产物、丝状酵母样真菌白松露发酵产物、丝状酵母样真菌松茸发酵产物、丝状酵母样真菌白桦茸发酵产物中的任意一种和环六肽。

22、进一步地，所述组合物包括丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物和环六肽，所述环六肽的序列为cyclo(gln-gly-pro-gln-gly-pro)。

23、在一些实施方式中，在最佳比例下(发酵产物为2.5％、环六肽为2％)，丝状酵母样真菌发酵产物组合物均具有显著抑制促炎症细胞因子tnf-α和炎症因子il-1α和il-8的表达，以及舒缓皮肤损伤的功效，且复配后的组合物协同增效能力显著，且当组合物优选组合2(白柳树皮发酵液+环六肽)时，具有最佳的抑制炎症因子表达和舒缓皮肤紫外光损伤的功效。

24、再一方面，本发明提供一种如上技术方案任一项所述的组合物用于制备抗衰祛皱、提高胶原蛋白含量或抑制mmp-1的制剂的用途。

25、在一些实施方式中，在最佳比例下(发酵产物为2.5％、环六肽为2％)，丝状酵母样真菌发酵产物组合物均具有显著促进collagen ι、collagenⅲ和collagenⅳ表达与抑制mmp-1表达的功效，且复配后的组合物协同增效能力显著，且当组合物优选组合2(白柳树皮发酵液+环六肽)时，具有最佳的抗皱功效。

26、再一方面，本发明提供一种如上技术方案任一项所述的组合物用于制备缓解氧化应激、提高抗氧化能力的制剂的用途。

27、在一些实施方式中，在最佳比例下(发酵产物为2.5％、环六肽为2％)，复配丝状酵母样真菌发酵产物和环六肽均可显著提升组合物的抗氧化能力，达到协同增效作用；且当优选组合2(白柳树皮发酵液+环六肽)时，抗氧化能力最强。

28、本发明的有益效果为：

29、1、本发明提供的一系列具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物，发酵合成方便，优选最佳比例后，生物相容性高且对人体安全无刺激，可以应用于化妆品领域。

30、2、本发明提供的一系列丝状酵母样真菌发酵产物作为皮肤调理剂调理皮肤表皮层，促进原有环六肽的渗透吸收，起到协同增效作用，使其发挥更强的效果。

31、3、本发明提供的一系列丝状酵母样真菌发酵产物中含有丰富氨基酸、多肽等，可直接供给皮肤细胞营养物质，优选最佳比例后，协同环六肽复配得到的组合物对角质形成细胞及成纤维细胞的光损伤有显著修复能力，同时显著增强其增殖能力，活化细胞，提供了其功效性实现的基础。

32、4、本发明提供的一系列具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物，优选最佳比例后，可以显著抑制ros/炎症因子或炎性介质il-1、il-8，tnf-α的表达，实现舒缓及缓解氧化应激的作用，还可显著性促进屏障相关的关键基因表达，帮助缓解屏障功能减弱的导致的皮肤干燥、脱屑等问题。

33、5、本发明提供的一系列具有多重功效的丝状酵母样真菌发酵产物组合物，优选最佳比例后，在光老化模型下能够明显促进胶原蛋白i、胶原蛋白iii和胶原蛋白iv基因的表达，显著改善了发酵组合物提升胶原蛋白含量的效果，为皮肤产生胶原蛋白提供理论依据，同时还能显著抑制mmp-1的产生，进而可以减缓胶原蛋白的降解。该促进生成-抑制降解两重通路机制平衡补充胶原蛋白从而能够对皮肤起到更好的抗衰祛皱作用。