一种用于修复退变核髓的载药微球及其制备方法与流程

本发明涉及医药材料，c08j3/00，尤其涉及一种用于修复退变核髓的载药微球及其制备方法。

背景技术：

1、椎间盘退变(ivdd)是腰痛的常见诱因之一，椎间盘由内部的髓核和周围包围的纤维环组成，由于髓核自身的不可再生特性，临床常用的保守治疗和手术治疗方法仅能针对的是患者的临床症状(如疼痛)，不能从源头上延缓、抑制或逆转椎间盘的退变，而且面临着手术损伤、临近节段退变加剧、长期疗效不确定等问题。因此，旨在抑制髓核退变、恢复髓核细胞数量和质量的治疗方法已成为椎间盘再生领域的研究热点。

2、髓核生物医学工程策略的目标是抑制核髓内部炎症反应、促进髓核细胞再生、恢复ecm合成及分解代谢平衡，最终恢复椎间盘正常的生理环境和功能；已有研究证明细胞外囊泡可以治疗ivdd，在椎间盘中有效发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡以及促进增殖等功能，并且携带生物活性分子转运到髓核细胞内，诱发一系列的级联反应，降低髓核细胞表达tnf-α、il-1β和il-6等促炎症因子。但是，技术中存在的主要问题就是单纯的给药药效维持时间短，不能长期维持炎症微环境的稳态。

3、中国专利cn114605676a公开了一种可注射的水凝胶及其在促进核髓再生方面的应用，其技术中通过苯硼酸、环糊精接枝的明胶、单宁酸形成凝胶体系包裹并负载姜黄素和mirna抑制剂，使后者能够缓慢释放，促进髓核细胞再生；中国专利cn115634214a公开了一种可注射水凝胶/多酚mirna载体缓释体系及其制备方法和用途，通过注射后原位成胶实现缓释并智能给药。但是以上技术中对药物的缓释效果仍然不够，无法更好地维持核髓退变组织的长期稳态环境，对核髓退变的治疗效果也有待提升。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于修复退变核髓的载药微球的制备方法，包括以下步骤：

2、s1、外泌体的制备；

3、s2、凝胶体系的制备；

4、s3、凝胶体系对外泌体的黏附和包裹。

5、进一步地，所述步骤s1中，外泌体来源于干细胞，更优选为脂肪间充质干细胞。

6、进一步地，所述步骤s1为：(1)采用不含外泌体的培养基培养干细胞，之后收集培养液去除死细胞和细胞碎片；(2)收集沉淀并消除蛋白质；(3)将外泌体制成混悬液，-80℃保存待用。

7、进一步地，外泌体的制备具体为：(1)将培养干细胞过后的培养液低速离心除去细胞成分，先将上清液于1800-2200g下离心去除死细胞，之后再于8000-13000g下离心消除细胞碎片，最后高速离心收集沉淀；(2)将沉淀重悬于pbs缓冲溶液中，消除蛋白质，再于高速离心下收集外泌体沉淀；(3)将外泌体沉淀制成混悬液，-80℃保存待用。

8、优选地，所述步骤(1)中低速离心转速为200-500g，离心7-13min；高速离心转速为80000-150000g，离心50-90min。

9、优选地，所述步骤(2)中高速离心转速为80000-150000g，离心50-90min。

10、进一步地，所述步骤s2中凝胶的主要成分包括：海藻酸(盐)、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、纤维素、聚乙二醇、瓜胶、透明质酸(盐)及其衍生物、葡聚糖中的至少一种或几种的组合。

11、在一种优选的实施方式中，所述凝胶的主要成分包括：甲基丙烯酰化透明质酸(hama)。

12、进一步地，所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量为100-500kda，甲基丙烯酸酐取代度为20-50％。甲基丙烯酰化透明质酸中甲基丙烯部分可光交联固化，分子链主体透明质酸提供微球骨架，控制甲基丙烯酰化透明质酸的分子量和取代度保证微球结构的稳定性和适合的孔径，促进对外泌体的包裹和释放效果；当分子量过高时，交联结构致密性下降，椎间盘髓核病变区域内的某些生物酶会对此结构产生破坏，导致缓释效果下降，而当甲基丙烯酸酐取代度过高时，光固化交联作用太强，导致外泌体释放过慢，短期治疗效果不佳。

13、在一种优选的实施方式中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量为100-150kda，甲基丙烯酸酐取代度为20-30％。

14、优选地，所述甲基丙烯酰化透明质酸经多巴胺改性；甲基丙烯酰化透明质酸和多巴胺的质量比为1：(0.6-3)，优选为1：(1-2)。本发明利用酰胺化反应将多巴胺接枝于甲基丙烯酰化透明质酸表面，调控凝胶溶液体系存在状态。

15、进一步地，所述步骤s2中凝胶的主要成分还包括交联促进剂，质量占甲基丙烯酰化透明质酸的10-40％，选自n,n-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(temed)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)中的至少一种。

16、在一种优选的实施方式中，所述交联促进剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，两者质量比为(1-5)：3。

17、甲基丙烯酰化透明质酸既具有透明质酸分子的大分子链，也具有可光固化的甲基丙烯基团，借助于交联促进剂使其固化后成形为具有多孔网络的微球分子对外泌体进行包裹和释放，延缓外泌体的药效发挥，但是这种微球结构对椎间盘的潮湿环境所表现的驻留能力并不够，在此基础上，本发明利用酰胺化反应将多巴胺对微球表面改性，通过多巴胺的大量极性基团和良好的生物相容性，增强多巴胺改性的微球对椎间盘髓核的黏附能力，使载药的微球在不渗漏出椎间盘的同时，还使外泌体持续释放，长效促进髓核细胞增殖并增加细胞外基质。然而，当交联促进剂的使用量过多时甲基丙烯酰化透明质酸的光固化程度太高，所制备的微球孔隙小且分布不均，导致治疗效果下降，治疗时间延长，而当多巴胺过量时，不仅会影响微球孔隙，还会影响体系的可注射性能。因此，需要严格控制三者的使用量，不仅要保证载药微球的多孔网络结构展现出特定孔隙以控制的外泌体释放速度，还要控制体系内微球分子间的作用力以使体系具有合适的流动性和可注射性。

18、进一步地，所述步骤s2为：将甲基丙烯酰化透明质酸溶于缓冲溶液中，再将交联促进剂加入其中混合，并置于28-40℃的摇床中活化，之后加入多巴胺在摇床中继续孵育4-8h；透析后再冷冻干燥，得到凝胶粉体备用。

19、进一步地，所述缓冲溶液包括但不限于pbs、tris、mes中的任意一种，缓冲溶液的ph为5-7。

20、进一步地，所述步骤s3采用同轴静电纺织法将凝胶对外泌体进行黏附和包裹形成微滴结构；之后在紫外光下照射固化形成微球，反复洗涤后保存备用。

21、进一步地，步骤s3中先将凝胶、外泌体和光引发剂混合制备混合液，置于同轴电纺喷头的内针中，再将油性溶液置于外针中，启动注射泵控制器，调节外针和内针流速得到凝胶裹的外泌体微滴；之后在紫外光下照射固化形成微球，收集微球并反复洗涤去除表面油剂，之后保存备用。

22、进一步地，所述微球的平均直径为50-500μm，优选为100-350μm。

23、进一步地，混合液中凝胶的质量浓度为4-15％，所述质量浓度为每百体积的溶液中所含有的凝胶粉体质量，即以w/v表示。

24、进一步地，混合液中所述外泌体的浓度为0.3-1.0mg/ml。

25、进一步地，混合液中所述光引发剂的质量浓度为0.1-0.8％。

26、进一步地，所述混合溶液中溶剂为水。

27、在一种实施方式中，所述内针和外针直径分别为30g和20g，混合液在内针中的流速为10-50μl/min，油性溶液在外针中的流速为250-600μl/min，通过调控流速控制微球尺寸。优选地，混合液在内针中的流速为20μl/min，油性溶液在外针中的流速为400μl/min。

28、进一步地，所述油性溶液为含有8-12wt％表面活性剂的有机溶液，溶剂包括但不限于油酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯中的至少一种。

29、进一步地，所述表面活性剂包括但不限于蓖麻油聚氧乙烯醚、司盘-80、司盘-60、吐温-80、吐温-20、吐温-60中的至少一种；优选为司盘-80。

30、进一步地，所述光引发剂包括但不限于2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(irgacure 2959)、1-羟基-环己基苯基甲酮(hcpk)、苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(irgacure 819)和2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦(irgacure tpo)、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)、氯菌酸酐(het)中的一种或多种的组合。

31、进一步地，所述紫外光照射的波长为200-600nm，优选为400-500nm，进一步优选为465nm。

32、进一步地，所述紫外光照射的强度为10-100mw/cm2；优选为10-50mw/cm2。

33、其次，本技术还提供了一种通过上述方法制备得到的载药微球，所述载药微球为黏附和包裹有外泌体的多巴胺改性甲基丙烯酰化透明质酸微球。

34、有益效果

35、1、本技术利用外泌体作为核髓修复的主要活性物质，从根本上调节核髓炎症微环境并促进细胞增殖，克服了髓核修复材料存在调控功能单一的缺陷；结合微流控技术对外泌体进行黏附和包裹制备载药微球，不仅能够靶向定植病变部位，还可通过长效释放外泌体调节“内外源”炎症微环境的稳态，重启ecm代谢平衡，从病因上阻止退变椎间盘的进展并促进髓核再生；

36、2、本技术利用具有维持细胞外基质代谢平衡功能的甲基丙烯酰化透明质酸构成凝胶体系的基本骨架，并在此基础上使用生物相容性好并具有抗炎症作用的多巴胺对其改性，增强微球在病理微环境中的黏附和滞留效果，进一步优化以上两者和交联促进剂的相对含量，调控凝胶体系交联状态，在保证微球结构稳定性的同时，还使其具有特殊的孔隙分布，促进药物的长效释放能力和可注射性能；

37、3、本技术优化同轴静电纺织工艺使负载外泌体的多巴胺改性甲基丙烯酰化透明质酸微球具有均匀和可注射的粒径，进一步提高微球对核髓病理微环境的治疗效果。