一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物，涉及一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，是人类面临的主要公共健康问题之一。接种疫苗是预防和控制流感流行最经济、最有效的手段。自1940年代问世以来，季节性流感疫苗限制了大流行性传播，挽救了无数生命。目前已批准的流感疫苗主要有灭活苗(全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗以及亚单位疫苗)、减毒活疫苗和重组疫苗。其中四价流感裂解疫苗对人群具有泛的保护作用和较低的副作用，在批准疫苗里占主流地位。

2、稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，生物制品其活性成分蛋白质或多肽的分子构型和生物活性的保持都依赖于所处的微环境，随着药品监督管理部门对药品的质量标准的要求不断提升，特别是各行业企业在产品的纯度和杂质控制方面体现出日渐趋高的态势，产品纯化程度越高，最终产品成分单一，有效成分的稳定性越发降低，免疫效果越差。在不断趋高的标准下，生产企业面临的技术压力和成本压力也在在逐步增大，生产能力难以获得突破。生产能力不足是限制疫苗供应的一个重要因素，另一个重要因素是疫苗的运输，冷链运输在发展中国家并不完善，提高流感疫苗的(热)稳定性和保质期是解决这个问题的重要途径。

3、现有传统流感病毒裂解疫苗制备工艺，主要流程为对纯化后病毒进行裂解后采用纯化步骤将裂解剂去除后低温灭活，如cn102614508a公开了一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法，包括以下步骤：1)生产用鸡胚：毒种传代和制备用鸡胚应来源于spf鸡群；疫苗生产用鸡胚应来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群，并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚；2)病毒接种和培育：用pbs稀释工作种子批毒种(h1n1型、h3n2型、b型)，接种鸡胚尿囊腔，接种后进行病毒培养；3)病毒收获：筛选活鸡胚，进行冷胚，收获尿囊液于容器内；4)浓缩及纯化：将h1n 1、h 3n 2、b型流感病毒尿囊液，进行连续流离心，离心得到的上清液用截留分子量300kd的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤浓缩后样品使用蔗糖密度梯度离心进行纯化，纯化后样品用截留分子量300kd的超滤膜包进行超滤除糖；5)病毒裂解：收集纯化的病毒液，加入triton x-100裂解，得到h1n 1、h 3n 2、b型流感病毒裂解液；6)裂解后纯化：流感病毒裂解液再经sepherose 4ff层析纯化，去除裂解剂，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为二次纯化液；7)病毒灭活：流感病毒二次纯化液经甲醛2～8℃灭活，得到h1n 1、h 3n 2、b型病毒灭活液，灭活后的病毒液以截留分子量50kd的超滤膜包进行超滤透析；8)除菌过滤：除菌过滤得到单价原液。所使用裂解主要包括使用有机溶剂或去污剂/表面活性剂处理，以去除表面糖蛋白，裂解剂对蛋白具有裂解的效果，被普遍认为是疫苗的一种杂质成分，各厂家采取各种纯化步骤组合的形式，力求将其去除，因此疫苗原液和成品中裂解剂的含量被控制在很低的水平。

4、综上所述，传统的流感病毒裂解工艺存在如下问题：病毒裂解后采用纯化步骤将裂解剂去除后2～8℃灭活，灭活时间较长，灭活过程中血凝素含量有下降趋势，最终原液和成品中裂解剂含量低，产品有效成分下降快，稳定性差，必须低温保存或冷链运输，所需能耗较大，压缩生产能力。因此，开发新型的流感病毒裂解疫苗制备方法，以实现高效制备具有高稳定性的流感病毒裂解疫苗，对于流感疫苗领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法，以期高效制备流感病毒裂解疫苗，提高疫苗稳定性，延长有效期，降低能耗，提高产能。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，所述制备方法包括：

4、将流感病毒与裂解组合物混合，进行裂解处理，将裂解处理后的流感病毒与灭活剂混合，进行灭活处理，对灭活处理后的流感病毒进行纯化，控制原液和成品中的裂解剂浓度分别为500～1500μg/ml和200～300μg/ml，得到所述流感病毒裂解疫苗，所述裂解组合物含有裂解剂和无水乙醇，所述裂解处理后不进行去除裂解剂处理。

5、本发明中，重新设计流感病毒裂解疫苗的制备工艺，在裂解剂中添加无水乙醇，无水乙醇可协同裂解剂对病毒进行裂解，缩短裂解时间，提高生产效率，裂解后，不进行裂解剂的去除，直接灭活，一定浓度裂解剂的残留可以保护抗原，提高血凝素稳定性，同时裂解后的流感病毒暴露出活性区域，加入灭活剂后可快速进行灭活，减少灭活剂的用量，缩短灭活时间，提高生产效率。

6、本发明中，同时控制最终疫苗原液的裂解剂含量在500～1500μg/ml(例如可以是550μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1300μg/ml、1450μg/ml、1480μg/ml或1490μg/ml)，成品的裂解剂含量控制在200～300μg/ml(例如可以是220μg/ml、250μg/ml、260μg/ml、280μg/ml或290μg/ml)，原液和成品的稳定性均可大幅提高。

7、本发明所述的原液和成品通过下列方法得到：

8、(1)单价原液：将灭活、纯化后的病毒液使用ph 7.4磷酸盐缓冲液进行稀释，控制蛋白含量在300～700μg/ml，裂解剂含量在500～1500μg/ml，除菌过滤后即为单价原液；

9、(2)成品：将各型单价原液与ph 7.4磷酸盐缓冲液稀释混合，裂解剂含量控制在200～300μg/ml。

10、可以理解，本领域通用的病毒裂解剂均适用于本发明。

11、优选地，所述裂解剂包括tritonx-100、tritonn-101、去氧胆酸钠、吐温、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇辛基苯基醚或乙醚中任意一种或至少两种的组合；

12、优选地，所述吐温包括吐温-20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温81或吐温85中任意一种或至少两种的组合；

13、优选地，所述裂解剂中表面活性剂和无水乙醇的体积比为1:(0.5～1)，包括但不限于1:0.6、1:0.7、1:0.8或1:0.9。

14、优选地，所述裂解处理的温度为20～28℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、25℃、26℃或27℃，时间为1～2h，包括但不限于1.2h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h或1.9h。

15、可以理解，本领域通用的病毒灭活剂均适用于本发明。

16、优选地，所述灭活剂包括甲醛、β-丙内酯、戊二醛、烷化剂或双氧水中任意一种或至少两种的组合。

17、优选地，所述灭活处理的温度为20～28℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、25℃、26℃或27℃，时间为4～8h，包括但不限于5h、6h或7h。

18、优选地，所述纯化处理的方法包括离心、层析、过滤或透析中任意一种。

19、优选地，所述过滤包括超滤或微滤。

20、优选地，所述流感病毒与裂解剂混合前经过纯化处理。

21、优选地，所述纯化处理的方法包括：

22、对流感病毒依次进行密度梯度离心、超滤及色谱柱层析处理。

23、优选地，所述表面活性剂的工作浓度为0.5％～1.0％，包括但不限于0.6％、0.7％、0.8％或0.9％。

24、优选地，所述灭活剂的工作浓度为0.1％～0.2％，包括但不限于0.13％、0.15％、0.17％或0.19％。

25、优选地，所述流感病毒包括h1n1型流感病毒、h3n2型流感病毒、bv型流感病毒或by型流感病毒中任意一种或至少两种的组合。

26、作为优选的技术方案，所述流感病毒裂解疫苗的制备方法包括：

27、对流感病毒进行纯化处理，将纯化处理后流感病毒与含有裂解剂和无水乙醇的裂解组合物混合，20～28℃，裂解处理1～2h，不进行去除裂解剂处理，将裂解处理后的流感病毒与灭活剂混合，20～28℃灭活处理4～8h，对灭活处理后的流感病毒进行纯化处理，控制原液和成品中的裂解剂浓度分别为500～1500μg/ml和200～300μg/ml，得到所述流感病毒裂解疫苗。

28、第二方面，本发明提供一种流感病毒裂解疫苗，所述流感病毒裂解疫苗由第一方面所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法制备得到。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、本发明中，利用裂解剂和无水乙醇协同进行裂解，缩短裂解时间，裂解后，不进行裂解剂的去除，只需常温灭活，有效缩短裂解灭活时间，提高灭活效率，灭活过程中血凝素回收率较传统灭活工艺高，灭活稳定；裂解灭活后不再对产品进行系统纯化，在原液和成品中保持较高水平的裂解剂，裂解剂可作为疫苗稳定剂，减少血凝素的下降速率，提高疫苗稳定性，延长有效期，无需冷链运输，防止不必要的疫苗损失，降低能耗，提高产能，提高经济效益和疫苗普及性。