一种脂滴衍生的核酸药物递送系统及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种脂滴衍生的核酸药物递送系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着生活水平的提高和生活方式的变化，肥胖日益成为人类健康的巨大威胁。肥胖症的主要病理表现为机体脂肪在体重中所占百分比过高，还可能存在脂肪细胞增大等情况，且通常伴有高血糖、高血脂等糖脂代谢失衡症状。目前对肥胖的治疗方法主要有药物治疗、外科手术和生活干预，但这三种方法目前均存在一定的缺点，如生活干预主要通过节制饮食和加强锻炼来使得机体能量支出大于输入，然而长期规律生活要依靠患者本人的意志力，对许多意志力薄弱的人疗效不稳定且易反弹。外科手术治疗则主要通过缩小胃的体积或在胃中填充气囊等方式增强饱腹感，从而使能量摄入减少，达到治疗的效果，但存在术后风险大、可能出现营养不良等问题，且能接受治疗的人群少。而药物治疗目前主要有奥利司他、氯卡塞林等药物，疗效较稳定，但由于没有良好的靶点导致其副作用较大，如奥利司他可能导致失禁。

2、rna干扰(rnai)是一种非常有效的基因沉默工具，它利用设计的小干扰rna(sirna)结合靶mrna并由细胞rna诱导沉默复合体(risc)切割靶mrna的能力。sirna设计和化学的进步与合适的递送平台相结合，克服了以前与未修饰sirna相关的许多限制。这导致了rnai疗法的巨大潜力。脂肪细胞内部甘油三酯的增加是肥胖症的诱因之一，甘油三酯合成中的关键酶二酯酰甘油酰基转移酶2(dgat2)可作为治疗肥胖症的潜在靶标。二酯酰甘油酰基转移酶2是生物体内的一种非常重要的酶,其主要机制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基辅酶a以共价健结合形成三酰甘油。dgat2在脂肪代谢旺盛的组织中的表达水平最高(如肝脏、白色脂肪组织)，这意味着它在脂质代谢中扮演着十分重要的角色。dgat2不仅在tag合成中起着十分重要的作用，且是动物生存所必需的。基于rnai疗法的应用效益，研究表明单次皮下给药可产生长期基因沉默的效用，实验表明成熟脂肪细胞内敲减dgat2表达能够有效抑制脂肪堆积，所以我们认为用小干扰双链rna化合物沉默dgat2具有改善肥胖症的治疗潜力。我们设计通过sirna靶向二酯酰甘油酰基转移酶2(dgat2)，使它通过抑制脂肪酰基辅酶a酯化为dag催化合成三酰基甘油的最后一步，来达到降低细胞内甘油三酯含量的作用效果，显著控制肥胖症患者中的脂肪堆积现象。

3、目前常见的用于基因治疗的核酸递送系统有阳离子脂质体、高分子聚合物等纳米结构，但这些基因递送载体存在毒性高、生物相容性低、免疫原性高、转染效率低等问题，对于核酸药物的细胞内递送有显著缺陷，同时体内递送效果也不理想。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术的不足和缺陷，本发明提供一种脂滴衍生的核酸药物递送系统，该系统具有免疫原性低、脂肪细胞选择性高、转染效率高等优势，并且以dgat2作为rnai技术靶点，调控脂肪生成过程，有效治疗肥胖症。本发明的系统有效解决了现有基因治疗核酸递送效率低、转染效率低、免疫原性高、递送载体毒性高等问题，并且脂滴具有均一稳定的优势，是具有应用价值的核酸递送载体。

2、本发明还提供基于脂滴的核酸药物递送系统的制备方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述方案，本发明提供所述一种基于脂滴的核酸药物递送系统，所述基于脂滴的核酸药物递送系统表面包覆有脂滴作为外壳，以sirna dgat2、pei作为内核其中，所述脂滴由前脂肪细胞3t3-l1进行成脂诱导形成。

4、其中，所述sirna dgat2所述sirna dgat2序列为：

5、5’-gguagagaagcagcuccaatt-3’

6、3’-uuggagcugcuucucuacctt-5’。

7、本发明所述的脂滴衍生的核酸药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)将3t3-l1细胞诱导提取脂滴；

9、(2)采用自组装法制备sirna dgat2和pei的核酸复合物；

10、(3)将脂滴和核酸复合物混合，共孵育后超声，得到脂滴衍生的核酸药物递送系统。

11、其中，步骤(1)中将3t3-l1在细胞生长状态良好时进行成脂诱导，当细胞出现体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴时进行脂滴的提取。

12、其中，步骤(1)中3t3-l1细胞诱导提取脂滴的具体过程为：3t3-l1细胞诱导脂滴细胞成功后，采用脂滴分离试剂盒将成脂细胞3t3-l1细胞用胰酶消化下来，洗涤后，然后将细胞重悬于缓冲液a中，并放置在冰上；向细胞悬液中加入缓冲液b并充分混合，然后在冰上继续孵育；将细胞均质化后进行离心，收集上层脂滴，冻干后保存。

13、缓冲液a：含有20mm tricine、250mm蔗糖的水溶液(ph值7.8)

14、缓冲液b：含有20mm hepes、100mm kcl、2mm mgcl2的水溶液(ph值7.4)。

15、其中，步骤(2)中采用自组装法将pei与sirna dgat2按n/p＝5:1-2孵育1-2h。即按照pei里面的氮和核酸里面的磷的摩尔比。

16、作为优选，按pei与sirna dgat2按n/p＝5:1，孵育1h。

17、其中，步骤(3)中每100ul脂滴和步骤(2)所得的含有20-30ug的核酸复合物混合，共孵育30-40min后超声5-10min，得到基于脂滴的核酸药物递送系统。

18、作为优选，所述基于脂滴的核酸药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：

19、步骤1，脂滴的诱导分化及提取

20、前脂肪细胞3t3-l1在细胞生长状态良好时进行成脂诱导，当细胞出现体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴时进行脂滴的提取。采用脂滴分离试剂盒将约3×107的成脂细胞用胰酶消化下来，并用1×pbs洗涤2次。然后将细胞重悬于200μl缓冲液a中，并放置在冰上10分钟。向细胞悬液中加入800μl 1×缓冲液b并充分混合，然后在冰上再孵育10分钟。接下来使细胞通过连接1英寸27号针的3ml注射器以进一步均质化细胞，重复该过程5次。细胞匀浆以100×g离心5秒，并小心地与600μl的1×缓冲液b分层。最后4℃、20000×g离心3小时，小心地收集上层脂滴，冻干后-80℃保存。

21、步骤2，采用自组装法制备sirna dgat2、pei的核酸复合物，sirna dgat2带负电荷而pei具有正电荷，pei与sirna dgat2的混合比率为n/p＝5:1条件下共孵育1h。

22、步骤3，将步骤1得到的脂滴和步骤2得到的核酸复合物混合，共孵育40min后超声，得到所述脂滴包裹的核酸复合物纳米粒。

23、本发明所述的肥胖症治疗药物中的应用在制备肥胖症治疗药物中的应用。

24、其中，所述肥胖症治疗药物中的应用在制备sirna dgat2基因治疗肥胖症药物中的应用。

25、本发明中脂肪细胞的脂滴对于脂肪细胞产生类似“归巢”作用，进而显著提高核酸药物进入细胞的效率。本发明通过设计一种脂滴衍生的核酸复合物递送载体，即用脂滴膜包覆核酸复合物，将dgat2的sirna递送至皮下白色脂肪组织以及内脏白色脂肪组织，以达到敲低dgat2的表达量，抑制脂肪组织的合成与过度积累，降低脂肪体积，降低体重减脂的功效。

26、本发明中sirna dgat2、pei以一定比例共孵育成为核酸复合物，核酸复合物带有正电性，并且与带有负电荷的脂滴通过正负电荷相互作用自组装形成纳米级别递送载体。本发明制备的系统中脂滴包载着sirna dgat2/pei的核酸复合物，对于腹股沟皮下白色脂肪组织进行抑制清除。通过建立高脂膳食诱发小鼠肥胖，本发明中的脂滴递药系统使用基因敲除及基因治疗技术，以dgat2为靶点，在全身及局部脂肪组织中敲减dgat2的表达，通过脂肪细胞对于脂滴的相似相溶特性，显著提高白色脂肪组织内dgat2的敲除效率，显著抑制体重的增长，降低脂肪体积，从而达到高效防治肥胖症的目的，为肥胖症患者提供一种安全高效的减脂方法，具有良好的应用前景，为肥胖症的治疗提供了一种新思路。

27、本发明基于脂滴衍生的核酸复合物递送系统，其内部包载sirna dgat2、pei的复合物。脂滴作为核酸递送系统的外壳具有均一稳定、免疫原性低、生物相容性高以及递送效率高等优良特性，可以在腹股沟以及内脏白色组织内显著敲低dgat2的表达量。本发明通过建立高脂膳食诱发小鼠肥胖，使用rnai技术，以dgat2为靶点，在腹股沟以及内脏局部脂肪组织中敲减dgat2的表达，结果表明，治疗组小鼠在高脂饮食刺激的条件下，极大限度的降低dgat2的表达并且能够显著抑制体重的增长，显著抑制白色脂肪细胞生长堆积，降低脂肪体积。因此，脂滴衍生的核酸递送载体在递送sirna dgat2时具有优良的作用效果，使得模型组肥胖小鼠达到高效治疗肥胖症的目的。本发明首次提出将脂滴衍生的核酸递送载体这一概念，并且也验证了该系统具有免疫原性低、脂肪细胞选择性高、转染效率高等优势，并且选择dgat2这一关键酶作为rnai技术靶点，调控脂肪生成过程，有效治疗肥胖症小鼠。

28、本发明利用脂滴作为核酸的递送载体，基于脂滴的核酸递送载体在生物安全性、递送效率上面具有高于其他载体的优势。同时，基于脂滴的核酸递送载体可以被机体脂肪细胞高选择性的摄取，这是由于脂滴是源于脂肪细胞，所以对于脂肪细胞有类似“归巢”的效应，这一设计原理可以有效支撑高递送效率的实验结果。

29、本发明首次以脂滴这作为核酸的递送载体，将核酸复合物加载到脂滴上，高选择性的被体内脂肪细胞摄取，并且低免疫原性的达到治疗效果。

30、有益结果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

31、本发明基于生物仿生技术制备了脂滴衍生的核酸递送系统，所使用的脂滴具有负电荷，其与带正电荷的sirna dgat2/pei复合物通过静电作用自发组装上载，形成囊状的纳米粒子。脂滴作为均一稳定的纳米结构来源，将其包覆在核酸复合物外层可增强脂肪细胞对核酸复合物的摄取，并且显著提高转染效率。

32、本发明的脂滴衍生的核酸递送系统，不仅具有更高的安全性和更低的免疫原性，降低了转染试剂存在的毒副作用，而且使得药物递送效率大幅度提升，使得sirna dgat2能达到更好的敲低效率，并且为脂肪组织的更多基因递送提供了一种更加有效的递送载体，具有十分广阔的应用前景。