一种红细胞搭便车偶联物及其制备方法和应用

本发明属于医药，具体的说是一种红细胞搭便车型(ss31-rapa)偶联物及其制备方法和在药物递送领域和治疗氧化应激损伤相关疾病中的应用。

背景技术：

1、活性氧(reactive oxygen species,简称ros)是一系列氧气未完全还原形式的总成，在细胞内线粒体中通过三羧酸循环和脂肪酸氧化等过程产生，主要包括超氧阴离子(o2·-)、过氧化氢(h2o2)、单线态氧(1o2)和羟基自由基(·oh)。在正常机体中，ros可以调节氧化还原平衡，对维持机体的各项生理功能起着十分重要的作用。过量产生的ros会造成线粒体内膜上特有的心磷脂过氧化并干扰线粒体内膜上微域的稳定性进而引起线粒体内膜的破损。这会导致位于线粒体内膜上的呼吸超复合物破损和细胞色素c从线粒体内膜上分离，大幅度降低线粒体内atp合成的速度，并且增加在呼吸链中电子的遗失，进一步促进ros的产生。除此之外，这一过程还会导致线粒体内膜的通透性发生改变，导致细胞色素c和线粒体dna等促凋亡和促炎性细胞因子进入细胞内，并导致细胞死亡。目前，大量研究表明，ros过量产生所引起氧化应激损伤在急性肾损伤、神经退行性疾病、手术后的缺血再灌注损伤、休克和炎症反应的发生中均扮演着十分重要的角色。因此，清除ros，保护线粒体的结构与功能成为了治疗氧化应激损伤导致的疾病的重要治疗方法。目前，ss抗氧化肽、coq10和mito-tempo等线粒体靶向ros清除剂以及没食子素、胆红素、姜黄素、槲皮素、奥替拉普和依达拉奉等抗氧化剂已经广泛应用于治疗ros过量产生而引起的氧化应激损伤相关疾病。

2、在这其中，ss31(arg-dmt-lys-phe-nh2)，作为一种抗氧化四肽，目前已经在临床试验中用于治疗多种线粒体相关的疾病，包括原发性线粒体肌病、巴氏综合征、心力衰竭和肾动脉血管手术后的缺血再灌注损伤等。ss31可以通过静电力和疏水作用力特异性结合线粒体内膜上特有的心磷脂，维持线粒体内膜的內脊和微域的稳定，进而保护线粒体的结构与功能，防止氧化应激引起的细胞损伤。然而，作为一种合成类多肽，ss31较差的药动学性质使得其并未获得理想的临床试验结果。目前，研究人员尝试改变ss抗氧化肽的氨基酸序列来改善其药动学性质，以获得更好的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明为改善抗氧化肽ss31的药动学特性和提高其在氧化应激引起的相关疾病治疗效果提供了新的策略和更多的选择，满足临床中对高效治疗急性氧化应激引起的相关疾病的迫切需求；进而提供一种红细胞搭便车型(ss31-rapa)偶联物及其制备方法和在药物递送领域和治疗氧化应激损伤相关疾病中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种红细胞搭便车型偶联物，偶联物结构为s-c-l-r，其中，s为抗氧化功能的多肽，c为敏感型连接臂，l为linker，r为能够与红细胞的结合蛋白靶点结合的物质；

4、或，偶联物的盐。

5、所述抗氧化功能的多肽为ss31(arg-dmt-lys-phe-nh2)、sbt-20(phe-arg-phe-lys-nh2)、sbt-68(arg-dmt-ala-phe-nh2)、sbt-100(arg-dmt-his-phe-nh2)或sbt-131(orn-dmt-lys-phe-nh2)。

6、所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物、基质金属蛋白酶或组织蛋白酶响应肽；其中，二硫醚衍生物为酮缩硫醇；基质金属蛋白酶响应肽为gplglagc肽段；组织蛋白酶响应肽为dved肽段。

7、所述linker的结构中一端含与自裂解结构相连的活性位点，另一端含能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质结合的活性位点，且，循环长度为peg4-peg10。

8、所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物时，linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位可以与红细胞内结合物质连接(r)，且，循环长度为peg4-peg10；敏感型连接臂为基质金属蛋白酶敏感肽时linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为peg4-peg10；敏感型连接臂为组织蛋白酶响应肽时linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为peg4-peg10。

9、所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素、他克莫司(fk506)、吡美莫司或依维莫司等。

10、所述抗氧化功能的多肽为ss31、sbt-20或sbt68，优选ss31；所述敏感型连接臂为酮缩硫醇、gplglagc肽段或dved肽段，优选dved肽；所述linker为peg6、peg8或peg10，优选peg6；所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素或他克莫司，优选雷帕霉素。

11、上述红细胞搭便车型偶联物的制备方法，以ss31为抗氧化肽，caspase-3响应断裂的dved肽段作为敏感键，peg6作为linker所构成的ss31-rapa偶联物(ss31-dved-rapa)的结构。其具体结构如下：

12、

13、方法如下：

14、(1)将丙炔醇乙氧基化合物三氟甲磺酸化得到三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯。再将其与rapa在dipea的催化下反应生成alkynyl-rapa。

15、(2)将ramage amide am resin树脂溶胀活化，采用固相肽合成的方法依次合成ss31和dved敏感肽。在固相合成柱中，使用dipea催化，将n3-peg6-ch2ch2cooh与肽段连接。最后将产物整体从树脂上切割下来，经制备液相分离纯化得到ss31-dved-peg6-n3。

16、(3)将alkynyl-rapa与ss31-dved-peg6-n3溶于甲醇，在cuso4和抗坏血酸钠的催化下使炔基和叠氮发生click反应，后经纯化得到终产物。

17、更具体为：

18、(1)合成2-丙炔基氧基乙基化修饰的rapa(alkynyl-rapa)：将1倍量的丙炔醇乙氧基化合物溶于二氯甲烷中，在-50℃下加入1～2倍量的2,6-二甲基吡啶和1～2倍量的三氟甲磺酸酐，在-10℃下反应1～2h，反应结束后用乙酸乙酯和正己烷的混合液与饱和nacl萃取，有机层用饱和nacl洗涤三次后用无水na2so4干燥过夜再通过减压旋转蒸发法除去有机溶剂，得到粗产物，通过硅胶柱层析法，以正己烷和乙酸乙酯(9:1)为洗脱剂进行纯化，得到产物三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯。将1倍量的rapa溶于氯仿中，在-10℃，n2保护的条件下加入2～8倍量的三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯和2-8倍量的dipea，然后升温至50～80℃，继续搅拌反应1～2h，反应后使用乙酸乙酯和h2o萃取，收集有机层并用饱和nacl溶液洗涤3次后，使用无水na2so4干燥过夜后，通过硅胶柱层析法进行分离，以正己烷和乙酸乙酯(2:1)为洗脱剂进行纯化，得到产物alkynyl-rapa。

19、(2)合成ss31-dved-peg6-n3：将ramage amide am resin树脂溶胀活化，使用20％吡啶的dmf溶液脱去树脂上的fmoc，将1倍量的fmoc-phe-oh与1～2倍量的pybop和2～5倍量的dipea溶于dmf后加入固相反应柱中，于室温下反应1-2h。待反应完成后，除去溶剂，向固相反应柱中加入含20％吡啶的dmf于室温下处理5-15min以脱去fmoc-phe-oh上的fmoc并用dmf和二氯甲烷多次洗涤。重复以上步骤，按照所设计好的序列连接氨基酸形成肽链。待肽链连接完毕后，使用20％吡啶的dmf脱去末端氨基上的fmoc保护基团，然后将1～2倍量的n3-peg6-ch2ch2cooh、1～2倍量的pybop和2～5倍量dipea溶于dmf后在冰浴环境下加入固相反应柱中，继续反应1-2h。待反应结束后，使用dmf和甲醇多次洗涤，最后用裂解液将产物从固相反应树脂上切割下来并脱去所有保护基团，通过制备液相进行纯化，得到产物ss31-dved-peg6-n3。

20、(3)将1倍量合成的alkynyl-rapa和1倍量的ss31-dved-peg6-n3共同溶于甲醇中，加入1～5倍量的cuso4和1～5倍量的抗坏血酸钠，于室温下超声反应1-2h，反应结束后使用0.45μm的滤膜过滤除去不溶物，最后纯化，得到终产物ss31-dved-rapa。

21、上述ss31-rapa偶联物(ss31-dved-rapa)的合成方法，其中

22、所述步骤(1)中，在三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯的合成中，优选1～2倍量的2,6-二甲基吡啶和1～2倍量的三氟甲磺酸酐，反应2h；在alkynyl-rapa的合成中，优选3～5倍量的三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯和5倍量的dipea，在60℃下反应2h。

23、所述步骤(2)中，在合成酰胺键的反应中，优选1倍量的pybop和4倍量dipea，反应2h；使用含有20％吡啶的dmf溶液脱去fmoc保护基团的过程中，优选反应5min。

24、所述步骤(3)中，click反应中，优选加入4倍量的cuso4和4倍量的抗坏血酸钠，超声反应2h。

25、一种所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，所述偶联物或其盐在制备药物递送载体中的应用。

26、一种所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，所述偶联物或其盐在制备预防或治疗氧化应激相关疾病药物中的应用。

27、本发明的优势在于：

28、(1)使用的ss31-rapa偶联物的合成过程采用成熟的反应技术，操作过程明确，易于制备。

29、(2)相比与传统的红细胞搭便车类制剂，本发明中的ss31-rapa偶联物无需后续处理，可直接增溶后注射，在血液内蓄积于红细胞中，完成红细胞搭便车的过程。无需纳米制剂的制备和引入其他辅料。

30、(3)偶联物结构中的rapa结构不仅仅可以用来结合红细胞内部的fkbp靶点，还可以抑制mtor通路刺激自噬过程，清除细胞内受损的细胞器，尤其是受损的线粒体这一ros最主要的来源，与ss31发挥协同治疗作用。增强其在治疗氧化应激损伤相关疾病中的疗效。

31、(4)本发明中的ss31-rapa偶联物具有在红细胞中的蓄积能力，同时该偶联物可以与红细胞发生动态结合从而实现红细胞搭便车，在包载到红细胞内以后可以释放出来。此外，本发明所述的ss31-rapa偶联物具有智能释放、长循环、低毒性和高效治疗氧化应激损伤的效果为开发氧化应激损伤微环境智能响应型药物递送系统提供了新的策略和更多的选择。满足了临床中对于急性氧化应激损伤相关疾病高效治疗制剂的迫切需求。