一种肿瘤细胞膜锚定功能化仿生制剂及其制备方法

本发明涉及生物医药制剂，具体为一种肿瘤细胞膜锚定功能化仿生制剂及其制备方法。

背景技术：

1、光动力疗法(photodynamic therapy，pdt)是一种依靠特定波长光源激活肿瘤组织中的光敏剂产生具有功能化生物毒性的活性氧物质(reactive oxygen species，ros)，进而氧化损伤肿瘤的一种治疗方式，具有微创、副作用小等优势。基于ros的作用距离较短，将光敏剂精准锚定在实体瘤细胞膜上是实现肿瘤高效精准pdt治疗的一种有前景策略。然而，传统载体或光敏剂作为外源物质存在易被机体免疫系统识别与清除、无法特异性针对肿瘤细胞进行光敏剂递送等技术问题，难以实现pdt精准高效治疗癌肿瘤的目的。

2、如：中国发明专利申请(申请公布号：cn 113456614a，申请公布日：2021.10.01)公开了一种基于plga的粒径可变型抗肿瘤仿生纳米制剂及其制备方法和应用，该方案的仿生纳米制剂包括plga，日蟾蜍他灵(cs-6)，光敏剂二氢卟吩e6修饰的peg化氧化石墨烯量子点(gc)和仿生杂化膜(hm)，光敏剂二氢卟吩e6(ce6)修饰在peg化氧化石墨烯量子点表面，日蟾蜍他灵(cs-6)和二氢卟吩修饰的peg化氧化石墨烯量子点(gc)包埋在plga中，合成纳米制剂(gc&cs-6@plga)，仿生杂化膜(hm)伪装在纳米制剂(gc&cs-6@plga)的外层合成仿生纳米制剂(gc&cs-6@plga[hm])。该方案的仿生纳米制剂具有杰出的肿瘤渗透能力，表现出良好的抗三阴性乳腺癌效果和抑制侵袭转移能力。

3、又如：中国发明专利申请(申请公布号：cn 115337281 a，申请公布号：2022.11.15)公开了一种靶向的工程化载药杂化细胞膜囊泡的制备方法及其应用。该方案先通过制备特定的稳定细胞系和单组分膜囊泡，制得工程化杂化细胞膜囊泡，进行小分子药物装载，即得到工程化载药杂化细胞膜囊泡。本发明制备的工程化载药杂化细胞膜囊泡主要成分来源于机体，生物相容性好，靶向性强，药物的生物利用度高；对肿瘤细胞具有普适的杀伤性，能够显著地抑制肿瘤细胞的生长，引起肿瘤细胞免疫原性死亡，从而激活机体免疫系统；能有效抑制术后肿瘤的复发和转移，具有明显的靶向术后部位的能力，可以显著改善术后的生存期，不会造成组织损伤，具有较好的体内生物安全性。

4、由上两种方案可知，近年来，基于细胞膜材料的药物递送系统发展迅速，理想的生物安全性赋予了其优异的转化潜力。其中，细胞膜衍生的脂质囊泡主要是利用其双层膜的疏水结构进行疏水性药物的包覆负载，然而，有限的双分子空间结构常常致使其对药物的载量相对较低；此外，脂质固有的流动性特质也常导致药物分子随着时间的推移出现大量泄露，成为限制这类载药系统进一步发展应用的关键因素之一。随着生物偶联技术的发展，基于代谢工程(metabolic engineering)与生物正交化学(bioorthogonal chemistry)的策略凭借其无损、高效、特异、稳定的特点，展现出其用于修饰细胞膜衍生递药系统的潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞膜锚定功能化仿生制剂及其制备方法，本发明的功能化仿生制剂通过叠氮基团与dbco修饰的光敏剂之间的点击化学反应进行药物装载，载药率相对更高，且随着时间的推移药物泄露相对较少，在具有良好的生物相容性同时，还具有较长的血液循环时间；另外，当功能化仿生制剂富集至肿瘤病灶区，在vsv-g作用下，光敏剂嵌入至实体瘤细胞膜上，于特定波长光源照射下原位产生ros，破坏实体瘤细胞膜结构，触发免疫原性的细胞焦亡发生，协同消融肿瘤，从而以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种肿瘤细胞膜锚定功能化仿生制剂，包括作为载体的杂化膜囊泡，所述的杂化膜囊泡由至少一种膜表面过表达叠氮化合物的免疫细胞和至少一种膜表面过表达膜融合蛋白的正常细胞经过细胞膜提取、膜融合制备而成，并且，所述的杂化膜囊泡上键接有光敏剂。

4、作为本发明进一步的方案，所述免疫细胞为巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞中的一种或多种；

5、所述正常细胞为人胚胎肾细胞、内皮细胞或成纤维细胞中的一种或多种。

6、作为本发明进一步的方案，所述光敏剂为5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(tapp)、二氢卟吩e6(ce6)、焦脱镁叶绿酸a己醚(hpph)、5-氨基酮戊酸(ala)中的一种或多种。

7、作为本发明进一步的方案，所述叠氮化合物具体为n-叠氮乙酰基氨基半乳糖-四酰化(ac4galnaz)，膜融合蛋白具体为vsv-g膜融合蛋白。

8、一种肿瘤细胞膜锚定功能化仿生制剂的制备方法，包括如下步骤：

9、s1、选取至少一种免疫细胞，通过与叠氮化合物共孵育，得到修饰有叠氮基团的免疫细胞，即为功能化免疫母细胞；

10、选取至少一种正常细胞，通过导入外源质粒，对正常细胞进行基因改造，得到膜表面表达有膜融合蛋白的正常细胞，即为功能化正常母细胞；

11、s2、分别对功能化免疫母细胞和功能化正常母细胞进行细胞膜提取，得到对应的功能化免疫细胞膜和对应的功能化正常细胞膜；

12、s3、对功能化免疫细胞膜和功能化正常细胞膜进行膜融合，制备得到功能化的杂化膜囊泡；

13、s4、通过点击化学反应，将光敏剂键接至功能化的杂化膜囊泡上，即可得到功能化仿生制剂。

14、作为本发明进一步的方案，所述步骤s1中功能化免疫母细胞的制备方法为：将佛波酯诱(pma)导成功的免疫细胞接种于dmem培养基中，于37℃培养箱中培养，直至细胞汇合度达到75-85％时，向dmem培养基中加入叠氮化合物，孵育48h；最后，以1500-2500rpm离心5-15min，收集细胞，并用pbs缓冲液清洗多次；

15、功能化正常母细胞的制备方法为：将正常细胞接种于dmem培养基中，于37℃培养箱中培养，直至细胞汇合度达到75-85％时，然后，根据lipo8000说明书，向dmem培养基中加入包装有表达vsv-g质粒的脂质体，通过lipo8000转染试剂转染细胞48h；最后，1500-2500rpm离心5-15min，收集细胞，并用pbs缓冲液清洗多次。

16、作为本发明进一步的方案，所述步骤s2中细胞膜提取的方法为：

17、将收集到的母细胞悬浮于细胞裂解缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂，随后，置于-80℃冰箱冷冻30min，取出解冻，冷冻-解冻循环4次后，使用离心机进行差速离心处理，得到对应的细胞碎片，保存在-80℃待用；

18、差速离心处理的过程为：首先以1500rpm的转速，离心30min得到上清液，再以12000rpm的转速，离心30min，得到下层细胞膜沉淀(即细胞碎片)。

19、作为本发明进一步的方案，所述步骤s3中膜融合的具体步骤为：

20、将纯化的功能化免疫细胞膜碎片和功能化正常细胞膜碎片混合，在冰浴中使用超声波发生器对混合后的细胞膜碎片进行超声波处理，超声波发生器功率为10w，处理时间为10min，然后，使用微型挤出器，通过聚碳酸酯多孔膜进行挤出，从而获得功能化的杂化膜囊泡；

21、其中，聚碳酸酯多孔膜孔径梯度为2μm、800nm、400nm和200nm。

22、作为本发明进一步的方案，所述步骤s4的具体步骤为：

23、光敏剂偶联复合物的制备：将氨基修饰的光敏剂与生物偶联化合物在室温下溶解于有机溶剂中，搅拌混匀反应20-30h；反应结束后，将产物转移至透析袋中，在含有tween80的去离子水中，透析30-50h，以除去未反应的光敏剂；最后，经冷冻干燥，以获得光敏剂偶联复合物；

24、光敏剂的键接：向杂化膜囊泡分散液中加入光敏剂偶联复合物，使用超声波发生器超声处理5-15min，超声波发生器功率为10w，并于37℃下孵育20-40min；然后，1100-1300rpm离心25-35min，除去游离的光敏剂偶联复合物，冷冻干燥，即获得功能化仿生制剂粉末，-80℃储存待用。

25、作为本发明进一步的方案，有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)，氨基修饰的光敏剂的溶液浓度为0.1～2mg/ml，生物偶联化合物为二苯并环辛炔-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(dbco-peg2000-nhs)，生物偶联化合物与光敏剂的投料摩尔比为1/5，tween 80的质量分数为1/1000。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

27、1、本发明功能化仿生制剂的构建过程是：首先，采用糖代谢技术将叠氮基团嵌入至细胞膜上，然后，将提取的叠氮基团功能化细胞膜与vsv-g功能化细胞膜融合，最后，通过叠氮基团与dbco修饰的光敏剂之间的点击化学反应装载药物进行药物装载，载药率相对更高，稳定性更好，随着时间的推移，药物泄露相对较少，在具有良好的生物相容性同时，还具有较长的血液循环时间；

28、2、本发明功能化仿生制剂富集至肿瘤病灶区，在vsv-g作用下，光敏剂嵌入至实体瘤细胞膜上，于特定波长光源照射下原位产生ros，破坏实体瘤细胞膜结构，触发免疫原性的细胞焦亡发生，协同消融肿瘤；

29、3、本发明采用基因工程制备功能化细胞膜，采用功能化生物正交反应负载光敏剂，并通过共挤出的方式制备功能化仿生制剂，制备方法简便；且制备的功能化仿生制剂具有生物相容性好、癌细胞摄取效率高以及载体毒性低等优点，是具有较高生产性价比，且高效、低毒的药物制剂；

30、4、本发明功能化仿生制剂中的单细胞膜组件可以单独定制，使得结构具有高自由度，在具体应用时，可根据癌症类型，选择相应的细胞膜制备功能化仿生制剂，因此，本发明的功能化仿生制剂可拓展应用至靶向治疗多种肿瘤。

31、综上所述，本发明的功能化仿生制剂通过点击化学反应装载光敏剂的策略克服了当前细胞膜衍生递药系统载药效率低和药物易泄露的难题；靶向实体瘤细胞膜的化学动力学疗法显示出更多效的生物学效应，为癌症的治疗提供广阔的应用前景。