一种冰片修饰的羧甲基壳聚糖的纳米颗粒及其应用

本发明属于生物材料。更具体地，涉及一种冰片修饰的羧甲基壳聚糖的纳米颗粒及其应用。

背景技术：

1、帕金森疾病(parkinson's disease，pd)是一种进行性、病因不明的神经系统退行性疾病，其发病机理复杂。其是继阿尔茨海默病后的第二种最常见的神经系统退行性疾病，其特征为黑质致密部多巴胺神经元减少、纹状体多巴胺耗竭、路易小体的出现，以及神经胶质细胞增生；中脑黑质致密区多巴胺神经元发生变性坏死，导致多巴胺(dopamine，da)神经递质生成减少。

2、从而造成患者出现运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势平衡障碍等一系列症状。临床上以运动迟缓、肌肉强直、静止性震颤和姿势步态不稳为特征。研究表明该疾病的发病机制包括以下几个方面：α突触核蛋白调控异常、免疫炎性、氧化应激、线粒体功能障碍以及胃肠道相关功能障碍。

3、目前，帕金森疾病在治疗方面包括药物治疗、外科手术治疗、干细胞疗法以及基因治疗。外科手术治疗包括脑深部电刺激术、胃肠手术等，其风险高、创伤大、并发症多；干细胞疗法包括胚胎干细胞、神经干细胞、充质干细胞、诱导多能干细胞等细胞的移植技术研发阶段，但操作技术不成熟；基因治疗包括rnai基因沉默及基因编辑手段但存在血脑屏障、生物利用度等问题；这是帕金森疾病早期治疗的最主要手段也是目前最常用的治疗手段就是药物治疗，其中包括左旋多巴、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物等，但是也存在血脑屏障和生物利用度等问题。

4、血脑屏障(blood-brain-barrier，bbb)血脑屏障由三层组成，由大脑微血管内皮细胞、基底膜、大量嵌入基底膜的周细胞、星形胶质细胞、紧密连接点和小胶质细胞组成。血脑屏障相关细胞存在多个内源性转运蛋白，其选择性允许营养物质和矿物质进入，限制了其他异物的进入。血脑屏障是大脑维持正常功能不可或缺的生理屏障，它能将脑内毛细血管与组织细胞有效分隔，并通过严格限制各类化合物进出、阻止血液循环中有害大分子及病原体的侵害，从而维持中枢神经系统的稳态。脑微血管内皮细胞之间形成的紧密连接是血脑屏障的主要物质基础，同时内皮细胞上的一些酶系统对保护和维持血脑屏障功能也起着重要作用。血脑屏障通过紧密连接和酶屏障严格限制了物质的入脑转运，它仅允许分子量小于500da的脂溶性小分子通过，98％的小分子和几乎100％的大分子物质不能穿过血脑屏障进入脑组织。因此，血脑屏障的存在严重影响了中枢神经系统的药物输送，使脑靶向药物递释面临严峻的挑战。

5、血脑屏障是阻碍帕金森药物治疗的主要问题，只有脂溶性和粒径足够小的纳米粒才可通过被动扩散的方式穿过血脑屏障。大多数纳米粒经受体和吸附介导的胞吞机制入脑，且主要由乳铁蛋白(lactoferrin，lf)受体介导。此外，聚焦超声诱导血脑屏障的打开也是克服血脑屏障给药的策略之一。为此，在利用纳米材料的药物治疗中，迫切需要克服血脑屏障探究纳米载体治疗脑部疾病的方法。

6、近年来，药物传递系统并广泛应用于疾病的诊断和治疗，在医学和生物学领域受到越来越多的关注。纳米技术在解决这些问题中展现了独特的优势。纳米材料不仅是递送药物和基因的良好载体，而且一些纳米材料还表现出神经保护作用。纳米颗粒具有紧凑的结构，药物可通过包裹或共价结合与纳米颗粒结合，纳米颗粒可以保护不稳定的药物并改善其水溶性，延长药物在血液中的循环时间，克服某些药物的固有缺陷。现有的纳米递送系统包括基于脂质的纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒和天然纳米颗粒。

7、纳米递药系统(nanparticles drug delivery system,npdds)的出现和逐步发展为脑靶向药物递释跨越血脑屏障带来了巨大的机遇。纳米技术的快速发展使得多种生物医学应用的纳米平台被设计构建用于疾病的诊断治疗。纳米材料的的小尺寸、高比表面并且在其结构进行修饰可提升nps的靶向性能、可以将药物携带到靶点处，将药物精准释放，以达到更好的治疗效果并且降低药物毒副反应、有效改善生物膜屏障的穿透性、组织器官的选择性分布和延长药物血液循环时间环为许多重大疾病治疗提供了新思路。近几十年来，用作药物递送系统的纳米颗粒一般是亚微米级颗粒(3～200nm)，包括聚合物(如聚合物纳米粒子、胶束或树枝状聚合物)，脂质(脂质体)，蛋白质(白蛋白，转铁蛋白)，病毒(病毒纳米粒子)，有机金属化合物(纳米管，mof)，甚至细胞衍生的纳米粒(如红细胞、肿瘤细胞、干细胞)等。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种冰片修饰的羧甲基壳聚糖的纳米颗粒及其应用。

2、本发明的第一目的是提供一种冰片修饰的羧甲基壳聚糖的纳米颗粒的制备方法。

3、本发明的第二目的是提供上所述制备方法制备得到的纳米颗粒。

4、本发明的第三目的是提供上所述纳米颗粒在制备治疗和/或改善帕金森药物中的应用。

5、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

6、冰片(右旋龙脑)(borneol，bo)作为一种珍贵的传统中药，具有开窍醒神之功，常用于热病神昏、中风痰厥等证。研究表明冰片可以在生理状态下增加血脑屏障通透性，病理状态下降低血脑屏障通透性。此外冰片还可以对脑缺血后神经元损伤具有保护作用。近年来越来越多的研究者使用冰片作为促透剂改善药物的入脑转运效率，增加药物在脑中的分布。现代药理研究显示，冰片可促进生理性血脑屏障开放，而且不会引起脑的病理性损害,并对脑及血脑屏障有一定的保护作用。本发明以小分子冰片作为载体修饰分子研究其在荷载药物的纳米制剂跨越血脑屏障转运中的应用。

7、迷迭香酸(rosmarinic acid，ra)是一种水溶性的天然酚酸类化合物。迭香酸可以使神经元活力增加,阻止ros水平和caspase-3活性异常升高，可以通过下调凋亡途径、抗氧化应激等方面改善帕金森疾病的进程。此外其对神经系统具有抗焦虑、抗抑郁、镇痛、抗氧化、抗突变和神经保护等多方面作用。

8、姜黄素(curcumin，cur)是一种从植物姜黄根茎中提取的多酚类化合物，在逆转神经退行性病变方面存在独特的优势，一方面，其可以通过抑制自由基的生成和促进自由基的清除，发挥神经保护作用；另一方面，姜黄素可抑制α-synuclein基因过度表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成，其可作为治疗帕金森疾病的药物。

9、羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，dmap)由壳聚糖经羧甲基化改性之后，使之成为既有含有正电荷的氨基又含有负电荷的羧基的两性聚电解质，生物相容性好，水溶性大大提高，多用于组织工程和药物运输。

10、因此本发明要求保护一种冰片修饰的羧甲基壳聚糖的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

11、hcr偶联物的制备：透明质酸、姜黄素与迷迭香酸反应生成hcr偶联物；

12、bc偶联物的制备：冰片与3,3′-二硫代二丙酸反应得到中间体；接着，中间体与羧甲基壳聚糖生成bc偶联物；

13、bc/p/hcr纳米颗粒的制备：hcr偶联物、bc偶联物和质粒混合反应，得到bc/p/hcr纳米颗粒。

14、优选地，所述质粒表达靶向抑制或靶向沉默gapdh基因和/或gapdh蛋白。

15、更优选地，所述质粒的靶序列为ctcactcaagattgtcagcaa(seq id no:1)的shrna表达载体。

16、进一步优选地，所述shrna表达载体为pgpu6/neo。

17、作为一个具体的实施例，所述质粒为在pgpu6/neo载体bbsⅰ和bamh i酶切为点之间插入有核苷酸序列为：caccgctcactcaagattgtcagcaattcaagagattgctgacaatcttgagtgagtt ttttg(seq id no:2)的核苷酸序列。

18、作为一个具体的实施例，所述质粒的制备方法为：将shrna模板与线性化的载体pgpu6/neo连接的得到，

19、所述shrna模板的正义链为：caccgctcactcaagattgtcagcaattcaagagattgctgacaatcttgagtgagtt ttttg(seq id no:3)；

20、所述shrna模板的反义链为：gatccaaaaaactcactcaagattgtcagcaatctcttgaattgctgacaatcttgag tgagc(seq id no:4)。

21、优选地，hcr偶联物的制备中，在催化剂dmap和edc存在的条件下，透明质酸、姜黄素与迷迭香酸发生反应生成hcr偶联物。

22、优选地，hcr偶联物的制备中，透明质酸、姜黄素与迷迭香酸发生酯化反应生成hcr偶联物。

23、更优选地，hcr偶联物的制备中，edc和dmap活化透明质酸的羧基，然后跟姜黄素混合后充分反应，再跟迷迭香酸混合后充分反应，纯化都即得。

24、更进一步优选地，hcr偶联物的制备中，edc和dmap活化透明质酸的羧基，然后跟姜黄素混合后充分35～45℃反应20～30h，再跟迷迭香酸混合后充分反应20～30h，纯化都即得。

25、再进一步优选地，hcr偶联物的制备中，edc和dmap活化透明质酸的羧基，然后跟姜黄素混合后充分40℃反应24h，再跟迷迭香酸混合后充分反应24h，纯化都即得。

26、优选地，hcr偶联物的制备中，透明质酸、姜黄素与迷迭香酸的用量摩尔比为1：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。

27、更优选地，hcr偶联物的制备中，透明质酸、姜黄素与迷迭香酸的用量摩尔比为1：1：1。

28、优选地，bc偶联物的制备中，在催化剂dmap存在的条件下，冰片与3,3′-二硫代二丙酸反应中间体。

29、优选地，bc偶联物的制备中，冰片和3,3′-二硫代二丙酸的用量摩尔比为1：(0.5～1.5)。

30、更优选地，bc偶联物的制备中，冰片和3,3′-二硫代二丙酸的用量摩尔比为1：1。

31、优选地，bc偶联物的制备中，中间体与羧甲基壳聚糖的用量质量比为1：(0.5～1.5)。更优选地，bc偶联物的制备中，中间体与羧甲基壳聚糖的用量质量比为1：1。

32、优选地，bc偶联物的制备中，中间体与羧甲基壳聚糖在dmap和edcl、nhs存在的条件下，反应生成bc偶联物

33、优选地，bc偶联物的制备中，中间体与羧甲基壳聚糖反脱水缩合反应生成bc偶联物。

34、优选地，bc/p/hcr纳米颗粒制备中，以质量计算，质粒、hcr偶联物、bc偶联物的用量为1：(10～20)：(10～20)。

35、更优选地，bc/p/hcr纳米颗粒制备中，以质量计算，质粒：hcr偶联物、bc偶联物的用量为1：15：15。

36、还要求保护所述制备方法制备得到的纳米颗粒。

37、以及所述纳米颗粒在制备治疗和/或改善帕金森药物中的应用。

38、优选地，所述药物为治疗和/或改善帕金森引起的运动迟缓、运动协调能力下降、和/或运动障碍的药物中的应用。

39、优选地，所述药物为治疗和/或改善帕金森引起的运动能力和/或神经损伤的药物中的应用。

40、因此本研究公开了一种以冰片修饰羧甲基壳聚糖用于治疗帕金森疾病的纳米药物，实现基因治疗与天然小分子药物治疗的双重效果。在紫外光谱分析、红外光谱分析、核磁分析、粒径表征、电位表征、透射电镜图、载药量与包封率测定及血清稳定性检测等一些列表征中，都表明冰片修饰的羧甲基壳聚糖得到的bc/p/hcr纳米颗粒的成功合成，大小均一、稳定性良好。在利用其的基因治疗中，质粒dna(pdna)提供了减少snca表达的有效方法，利用质粒pdna进行基因治疗具有免疫原性低，转基因能力灵活；羧甲基壳聚糖用于包裹携载pdna，保护pdna在体内循环时免遭酶解；在天然小分子药物治疗中，姜黄素一方面可抑制α-synuclein基因过度表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成，另一方面抑制自由基的生成和促进自由基的清除；迷迭香酸可以使神经元活力增加，阻止ros水平和caspase-3活性异常升高，下调凋亡途径、抗氧化应激等方面的作用。外壳表面修饰的冰片能增加复合粒子的生物相容性和血脑屏障透过性，促进药物到达病变部位从而显著增加纳米粒子的治疗效果。

41、将bc/p/hcr纳米颗粒应用于c57bl/6帕金森小鼠模型，其能够增加血脑屏障的开放，姜黄素、迷迭香酸以及核酸药物具有改善小鼠的运动能力和神经损伤的效果。bc/p/hcr纳米颗粒能改善帕金森模型鼠动物的运动障碍；且与c/p/hcr纳米颗粒组和bc/hcr纳米颗粒组相比，bc/p/hcr纳米颗粒对帕金森模型鼠的行为学改善更为明显，证明bc/p/hcr纳米颗粒具有增加打血脑屏障，增加药物递送脑内；核酸药物(pdna)具有改善小鼠的运动能力和神经损伤的效果，从而改善帕金森疾病的进程。

42、综上所述，bc/p/hcr纳米颗粒对mptp诱导的帕金森模型鼠黑质多巴胺能神经元有一定的保护作用，可以改善模型鼠的行为学，也表现出良好的生物相容性，可以改善帕金森患者症状，提高帕金森病人生活质量的潜在药物。

43、本发明具有以下有益效果：

44、因此本发明公开了一种增强血脑屏障通透性且低毒副作用的冰片修饰的羧甲基壳聚糖荷载天然小分子纳米胶束和pdna的纳米颗粒。其以羧甲基壳聚糖作为纳米载体，水溶性较好并且具有良好的生物相容性、生物可降解性；再以冰片作为促血脑屏障开放的功能基对纳米材料进一步修饰，增加了纳米颗粒的血脑屏障透过率和基因转染效率。其外壳结构bc不仅能很好地保护小分子药物姜黄素、迷迭香酸以及基因药物pdna，防止其提前泄露，延长小分子药物在体内的停留时间，而且能增加复合粒子的血脑屏障透过性，增加药物进入脑内，达到多巴胺能神经元的保护从而治疗帕金森疾病。将纳米药物注入帕金森小鼠体内后，姜黄素、迷迭香酸以及核酸药物具有改善小鼠的运动能力和神经损伤的潜在效果。然后进一步研究发现纳米粒子对小鼠的主要器官如心，肝，脾，肺，肾不会造成明显损伤。