联合调控细胞周期和Atoh1表达在治疗前庭功能障碍中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种联合调控细胞周期和atoh1表达的试剂在治疗前庭功能障碍中的应用。

背景技术：

1、内耳前庭毛细胞承担着感受头部运动并通过机-电转换参与维持机体平衡的重要作用。在临床上，前庭毛细胞容易受到耳毒性药物如氨基糖苷类抗生素或顺铂，以及年龄增长或自身免疫等因素损伤从而产生眩晕、平衡障碍等症状，严重影响患者的生活质量。哺乳动物前庭毛细胞损伤之后自发性再生能力有限，再生过程中缺乏有丝分裂，主要以支持细胞转化为主，感觉上皮各种细胞比例明显失调，且再生的毛细胞数量远低于正常水平。由于前庭系统尚缺乏有效的人工替代装置，目前前庭功能的恢复只能依靠有限的中枢代偿作用。因此，找到行之有效的方法促进前庭毛细胞充分再生对于平衡障碍的患者来说至关重要。

2、目前现有技术中促进前庭支持细胞向前庭毛细胞发生转化是前庭毛细胞再生的主要手段。但是，通过此方法促进前庭毛细胞再生将带来一个明显的问题：由于成年哺乳动物支持细胞缺乏有丝分裂，前庭支持细胞向前庭毛细胞发生转化后其自身数量明显减少。而前庭支持细胞对于维持内耳感觉上皮的正常功能具有不可或缺的意义。通过单一的前庭支持细胞转化实现前庭毛细胞再生，造成前庭毛细胞与前庭支持细胞比例失衡，可能是目前研究中哺乳动物前庭功能难以恢复的一个重要原因。能否通过增加哺乳动物前庭毛细胞再生过程中的有丝分裂程度，对于前庭毛细胞充分再生、维持前庭毛细胞与前庭支持细胞比例平衡，从而实现前庭功能恢复变得十分重要。

3、细胞周期依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor, cdki）在内耳胚胎发育的过程中介导祖细胞脱离细胞周期，结束有丝分裂。非专利文献：p27(kip1) isrequired to maintain proliferative quiescence in the adult cochlea andpituitary（oesterle elizabeth c,chien wei-ming,campbell sean et al., cellcycle, 2011, 10: 1237-48.）公开了抑制新生小鼠内耳感觉上皮的cdki如p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb等因子表达，能够促进已分化的感觉上皮细胞重新进入细胞周期，产生有丝分裂细胞，但随着年龄的增长，内耳感觉上皮对于cdki调控的反应迅速减少，成年小鼠内耳感觉上皮有丝分裂数量极少。由于人类与小鼠内耳发育并不同步，小鼠出生时内耳发育尚不成熟，只相当于人类胚胎约23周水平，而人类内耳出生时已经发育成熟，针对新生小鼠进行的有丝分裂研究对于临床实践的参考价值有限。且在临床中，前庭感觉上皮遭受药物、免疫、感染、老龄等因素损伤从而产生眩晕症状的情况更常见于成年患者。

4、非专利文献：life after deaf for hair cells（ruth taylor af, science2005; 307 (5712):1056-1058.）和非专利文献：proliferation of functional haircells in vivo in the absence of the retinoblastoma protein（sage c, huang m,karimi k, et al., science 2005; 307 (5712):1114-1118.）公开了p27kip1基因持续表达于分化成熟的支持细胞，维持其细胞周期的稳定性。非专利文献：progressive hearingloss in mice lacking the cyclin-dependent kinase inhibitor ink4d（chen p,zindy f, abdala c, et al., nature cell biology 2003; 5 (5):422-426.）公开了虽然抑制cdki能够诱导有丝分裂，但分裂的细胞无法继续向成熟的感觉上皮细胞分化，很快启动凋亡程序而不能长期存活。并且在专利文献（cn112359018a）也公开了通过例如阻断rb1和p27kip1的途径检测了胚胎小鼠或新生小鼠中的毛细胞重新进入细胞周期的情况，但毛细胞一般随后死亡。然而，在成年小鼠内耳中的类似处理未曾诱导使其重新进入细胞周期。因此，如何克服成年哺乳动物有丝分裂稀缺的瓶颈，对于恢复前庭感觉上皮的正常结构，从而应用到在临床上防治眩晕至关重要。

5、另外，由于前庭感觉上皮的损伤最突出的表现为毛细胞受损，如何促进增殖后的前庭支持细胞转化为前庭毛细胞，从而恢复感觉上皮的正常结构更为重要。

6、专利文献（cn111655228a）公开atoh1作为一种转录因子，可以将新生儿和少年哺乳动物耳蜗中的支持细胞转换为毛细胞，但atoh1诱导的毛细胞转化效率低（＜17%）、不完全（缺乏成熟的毛细胞标记物）和年龄依赖性（成年耳蜗无反应）。

技术实现思路

1、为解决再生毛细胞数量有限、且支持细胞数量减少造成两种细胞比例失调的矛盾。本技术提供了一种通过同时促进已分化的感觉上皮细胞重新进入细胞周期并过表达atoh1的方法，不仅可以促进前庭感觉上皮（如前庭支持细胞和/或前庭毛细胞）细胞重新进行有丝分裂，还可以促进前庭支持细胞向前庭毛细胞的转化，有助于修复内耳感觉上皮的正常结构，能够用于治疗和/或预防前庭功能障碍（特别是眩晕或平衡障碍等）。

2、本发明的第一方面，提供了一种试剂在制备治疗和/或预防前庭功能障碍的产品中应用，所述的试剂包括：

3、1）促进已分化的感觉上皮细胞重新进入细胞周期或感觉上皮细胞再生的试剂i；和，2）表达atoh1的试剂ii。

4、优选的，所述的感觉上皮是指含有感觉上皮细胞（初生的、次生的），具有刺激的感受机能的上皮组织。

5、优选的，所述的感觉上皮细胞包括前庭支持细胞和/或前庭毛细胞。

6、优选的，所述的试剂i可以是现有技术中任一可以促进已分化的感觉上皮细胞重新进入细胞周期或再生的材料。

7、优选的，所述的试剂i抑制p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb中的一种或两种以上。进一步优选抑制前庭感觉上皮细胞或组织或前庭组织中的p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb。

8、其中，p19ink4d为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2d，编码cdkn2d蛋白；

9、p21cip1为周期素依赖性激酶抑制因子1a，编码cdkn1a蛋白；

10、p27kip1为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1b，编码cdkn1b蛋白；

11、rb为视网膜母细胞瘤抑制蛋白，编码rb蛋白。

12、在本发明的一个具体实施方式中，所述的试剂i抑制p27kip1。

13、进一步优选的，所述的试剂i包括但不限于干扰rna、反义寡核苷酸、抗体、拮抗剂、阻断剂、micro rna或基因编辑所需要的材料中的一种或两种以上。

14、所述的试剂i为组织特异性敲除所需材料。优选包括cre/loxp重组酶系统所需的材料，例如使用病毒或非病毒载体将cre和/或loxp导入的试剂。

15、进一步优选的，所述的基因编辑所需要的材料包括但不限于crispr/cas系统所需的材料、flp/frt重组酶系统所需的材料或cre/loxp重组酶系统所需的材料中的一种或两种以上。

16、优选的，所述的干扰rna包括但不限于sirna、dsrna、shrna、airna或mirna中一种或两种以上。

17、优选的，crispr/cas系统中使用的cas蛋白选自casl、caslb、cas2、cas3、cas4、cas5、cas5d、cas5t、cas5h、cas5a、cas6、cas7、cas8、cas9、caslo、csyl、csy2、csy3、csy4、csel、cse2、cse3、cse4、cse5e、cscl、csc2、csa5、csnl、csn2、csml、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csx17、csx14、csxlo、csx16、csax、csx3、csxl、csxls、csfl、csf2、cso、csf4、csdl、csd2、cstl、cst2、cshl、csh2、csal、csa2、csa3、csa4、csa5、c2cl、c2c2、c2c3、cpfl、carf、ding、其同源物或其修饰形式。

18、所述的cre/loxp重组酶系统是一种特定位点的重组酶技术，可在dna的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中dna进行修改。cre重组酶识别loxp位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体，然后此二聚体与另一个loxp位点上的二聚体结合形成一个四聚体。loxp位点是有方向性的，四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。然后两个loxp位点间的dna序列被cre重组酶切断。接着，dna连接酶快速高效地将这些链连接起来。如果两个loxp位点位于同一条dna链上且方向相同，cre重组酶介导loxp间的序列切除；如果两个loxp位点位于同一条dna链上且方向相反，cre重组酶介导loxp间的序列反转；如果两个loxp位点位于不同的dna链或染色体上，cre重组酶介导两条dna链发生交换或染色体易位。

19、在本发明的一个具体实施方式中，所述的试剂i包括cre/loxp重组酶系统所需的材料，所述的cre/loxp重组酶系统中两个loxp位点设置在目标基因两端，同向排列（flox/flox），然后再导入cre重组酶，介导loxp间的序列切除。

20、优选的，所述的试剂ii可以是现有技术中任一可以表达atoh1的材料。

21、优选的，所述的试剂ii包括但不限于载体、促进atoh1基因转录的因子或atoh1蛋白激活剂中的一种或两种以上，所述的载体包含编码atoh1蛋白的核酸。

22、所述试剂ii可以上调感觉上皮细胞或组织，或者前庭中的atoh1（mrna或蛋白）表达量。

23、优选的，所述的试剂包括：

24、1）敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体；和2）表达atoh1的载体。

25、优选的，敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体包含cre重组酶编码序列和/或loxp序列。

26、进一步优选的，所述的试剂包括：

27、1）敲除或敲低前庭感觉上皮细胞或组织或前庭器官中的p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体；和2）在前庭感觉上皮细胞或组织或前庭器官中表达atoh1的载体。

28、在本发明的一个具体实施方式中，所述的试剂包括：

29、1）敲除或敲低前庭感觉上皮细胞或组织或前庭器官中的p27kip1的载体；和2）在前庭感觉上皮细胞或组织或前庭器官中表达atoh1的载体。

30、优选的，所述的载体可以是病毒载体或非病毒载体。

31、进一步优选的，所述的非病毒载体包括但不限于能与基因编辑片段形成复合物并促进细胞内基因的人工合成或天然化合物，载体材料可选自例如脂类、聚合物、蛋白质和多肽。

32、进一步优选的，所述的病毒载体包括但不限于慢病毒载体、假病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或巨细胞病毒载体。

33、所述的病毒载体由cmv早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子驱动。

34、优选的，所述的腺相关病毒载体包括但不限于aav1载体、aav2载体、aav3载体、aav4载体、aav5载体、aav6载体、aav7载体、aav8载体、aav9载体、aav2.7m8载体、aav8bp2载体、aavie载体或aav293载体中的一种或两种以上的组合。

35、优选的，所述的敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体，和，表达atoh1的载体为相同的载体或不同的载体。

36、进一步优选的，所述的敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体，和，表达atoh1的载体均为腺相关病毒载体，更优选为aavie载体。

37、在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达atoh1蛋白的载体为aavie载体。

38、优选的，所述的前庭功能障碍包括前庭感觉上皮损伤相关疾病。

39、所述的前庭功能障碍可以个体是由于任一因素产生的疾病，进一步优选包括前庭毛细胞受到耳毒性药物（如氨基糖苷类抗生素或顺铂）、年龄增长或自身免疫等因素中的一种或两种以上导致的疾病。

40、优选的，所述的前庭功能障碍包括但不限于眩晕、双侧前庭病、振动幻视或平衡障碍中的一种或两种以上。

41、优选的，所述的眩晕包括但不限于外周性眩晕。

42、优选的，所述的治疗和/或预防前庭功能障碍包括诱导感觉上皮细胞重新进入细胞周期和/或促进感觉上皮细胞再生，和/或，增殖支持细胞并将支持细胞转化为毛细胞。

43、优选的，所述的治疗和/或预防前庭功能障碍包括通过个体耳部施加所述的试剂或产品，进一步优选通过个体前庭器官施加所述的试剂或产品，更优选通过前庭器官的半规管施加所述的试剂或产品。

44、本发明的第二方面，提供了一种试剂或药物组合物，所述的试剂或药物组合物包括：

45、1）敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体；和，2）表达atoh1的载体。优选的，所述的载体为病毒载体或非病毒载体，进一步优选为病毒载体。

46、优选的，对敲除或敲低p19ink4d、p21cip1、p27kip1或rb的载体，和，表达atoh1的载体的相关限定同本发明的第一方面。

47、优选的，所述的试剂或药物组合物诱导感觉上皮细胞重新进入细胞周期和/或促进感觉上皮细胞再生。

48、优选的，所述的感觉上皮细胞包括前庭支持细胞和/或前庭毛细胞。

49、优选的，所述的试剂或药物组合物治疗和/或预防前庭功能障碍。优选的，所述的前庭功能障碍包括但不限于眩晕、双侧前庭病、振动幻视或平衡障碍中的一种或两种以上。

50、优选的，所述的眩晕包括但不限于外周性眩晕。

51、优选的，所述的药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

52、优选的，所述的药学上可接受的辅料选自稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、ph调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、金属离子螯合剂、抑菌剂或等渗调节剂中的一种或两种以上的组合。

53、优选的，所述药物组合物的制剂形式可以为悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水溶液、霜剂、凝胶剂或乳剂。所述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。

54、优选的，药物组合物制剂优选为单位剂量制剂。单位剂量制剂中药物活性组分的量可从0.001毫克到1000毫克改变或调整，根据药物活性组分的具体应用和效力而定。

55、根据具体实施方式的需要，所述的药物组合物中还可以包含其它适合的治疗剂。

56、所述的药物组合物适于非肠胃给药诸如例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径给药的制剂包括含水和非水的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和使制剂与接受者的血液等渗的溶质，以及含水和非水的无菌悬浮剂，其可包含助悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂或防腐剂。制剂可存在于单位剂量或者多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中。注射用溶液和悬浮液可从先前所述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。

57、优选的，药物组合物的给药方式包括但不限于静脉输注，局部给药，腹膜内给药或鞘内给药等等。

58、在本发明的一个具体实施方式中，所述的给药方式为局部给药，优选为耳部给药，进一步优选为前庭器官给药，更优选通过前庭器官中半规管给药。

59、优选的，所述的半规管选自前半规管、后半规管和水平半规管。

60、可以理解的是，通过半规管给药，特异性靶向个体前庭器官，能够避免由于使用药物而导致的全身性副作用。

61、优选的，所述的药物组合物可以单独使用，也可以和其他的治疗剂共同使用。

62、本发明的第三方面，提供了一种治疗和/或预防前庭功能障碍的方法，所述的方法包括使用上述第二方面所述的试剂或药物组合物。

63、优选的，所述的前庭功能障碍包括前庭感觉上皮损伤相关疾病。

64、所述的前庭功能障碍可以个体是由于任一因素产生的疾病，进一步优选包括前庭毛细胞受到耳毒性药物（如氨基糖苷类抗生素或顺铂）、年龄增长或自身免疫等因素中的一种或两种以上导致的疾病。

65、优选的，所述的前庭功能障碍包括但不限于眩晕、双侧前庭病、振动幻视或平衡障碍中的一种或两种以上。

66、优选的，所述的眩晕包括但不限于外周性眩晕。

67、本发明的第四方面，提供了一种诱导感觉上皮细胞重新进入细胞周期和/或促进感觉上皮细胞再生的方法，所述的方法包括使用上述第二方面所述的试剂或药物组合物。

68、优选的，所述的感觉上皮细胞包括前庭支持细胞和/或前庭毛细胞。

69、优选的，所述的方法包括向个体耳部给药。

70、优选的，所述的方法包括向个体前庭器官施加上述第二方面所述的试剂或药物组合物。

71、进一步优选的，所述的方法包括向个体前庭器官的半规管施加上述第二方面所述的药物组合物或试剂。

72、优选的，所述的半规管选自前半规管、后半规管和水平半规管。

73、在本发明的一个具体实施方式中，所述的半规管为后半规管。

74、优选的，所述的方法可以用于治疗前庭功能障碍。进一步优选的，对前庭功能障碍的相关限定同本发明的第一方面。

75、本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

76、本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。

77、本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

78、本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

79、本发明的有益效果：

80、1. 本技术在成年哺乳动物前庭共同调控p27kip1与atoh1表达，评估同时调控两条通路对前庭感觉上皮增殖和前庭毛细胞再生的作用，观察到二者强烈的协同作用，实现了成年哺乳动物前庭感觉上皮大量有丝分裂及在此基础上发生的前庭毛细胞再生。有助于未来治疗前庭功能障碍（特别是眩晕或平衡障碍等）。

81、2.目前的技术手段尚无法在成年哺乳动物内耳实现大量有丝分裂，这是目前毛细胞再生领域的一个重要瓶颈。而由于人类与实验小鼠内耳发育的不同步性，成年小鼠的实验结果对于临床疾病的治疗才更有参考价值。本技术在成年小鼠内耳观察到大量有丝分裂基础上实现的前庭毛细胞再生，是外周性眩晕治疗相关研究领域的一个重要突破。

82、3. 目前研究中多采用转基因鼠结合他莫昔芬注射的方式实现基因调控，但由于p27kip1与atoh1都表达在全身多个重要器官，无法避免全身副作用，动物无法长期存活，对于临床应用的实施和参考价值有限。本技术，利用内耳具有骨性包囊这样一个解剖优势，创新性采用转基因鼠结合内耳局部注射的方式，将病毒载体携带的cre元件精准注射到小鼠内耳前庭，实现组织特异性的基因调控，从而避免了全身副作用，动物能够长期存活。