一种糖响应脂质体、用于糖尿病环境下骨再生的取向电纺膜及其制备方法

本发明属于骨再生领域，具体涉及糖响应脂质体的制备、有序纺丝的制备以及i型胶原自组装等方法，其中包括：一种具有葡萄糖响应基团的脂质体材料，一种用于糖尿病环境下骨膜再生的时空免疫调节和/或骨血管再生的取向电纺膜，以及其制备方法。

背景技术：

1、糖尿病(dm)是一种长期代谢紊乱性疾病，2017年影响了全球4.25亿人，到2035年，糖尿病患者人数估计将超过6.29亿。除了众所周知的大血管和微血管并发症，如中风、视网膜病变、神经病变和肾病，患有糖尿病的患者比健康人骨折的风险更高，这与他们的葡萄糖代谢紊乱和体内基础炎症水平增加有关，糖尿病会使骨折的风险增加20-300％。通常，骨膜在骨折愈合的早期阶段有助于70％以上的骨和软骨形成。但在dm微环境中，慢性炎症和晚期糖基化终产物的过度积累以及活性氧的存在，可能会损害间充质干细胞的激活分化，这将导致成骨分化减弱，血管生成减少，骨膜愈合不良加重，最终导致骨缺不愈合。因此，必须重新审视糖尿病患者的骨膜再生策略。

2、目前，有许多方法可用于改善骨骼愈合，包括药物、生长因子、超声波、激光和脉冲电磁场；但骨形成不足以及无法准确可控地释放生长因子，限制了现有这些方法的应用。此外，还可以采用骨修复材料辅助治疗，但传统的骨修复材料主要侧重于优化成骨，它们通常采用惰性材料来避免免疫排斥，忽视了免疫系统在组织修复和再生中的本质功能。忽视免疫调节，只关注骨诱导，往往无法适应病理微环境。

3、作为先天系统的主要防御，巨噬细胞具有抗炎和治疗表型(m2)，可缓解炎症并为骨骼再生提供有益的免疫微环境。然而，dm微环境通常伴随着血糖水平的波动，这进一步延长了促炎表型(m1)巨噬细胞的局部停留时间，并显著延迟了m2巨噬细胞的产生，进一步加重炎症并导致骨修复过程中的损伤。因此，在慢性炎症条件下从m1到m2表型的动态转变难以完成。综上所述，合理设计能够动态响应血糖水平变化的骨修复材料，并具有免疫调节和骨诱导等多种功能，对于促进糖尿病患者的骨愈合具有重要意义，这样的材料有望提供更有效的治疗策略，并改善骨骼健康和功能恢复。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种糖响应脂质体、用于糖尿病环境下骨再生的取向电纺膜及其制备方法，本发明提供的取向电纺膜为复合功能支架材料，能够在波动的高葡萄糖炎症微环境中调节免疫功能，实现相对稳定和有利的成骨微环境，有利于功能化生物材料的有效设计，用于糖尿病患者的骨再生治疗等。

2、本发明提供一种糖响应脂质体，以磷脂类物质、胆固醇和氟苯硼酸接枝物为原料制备得到，所述氟苯硼酸接枝物为磷脂对氟苯硼酸接枝物或胆固醇对氟苯硼酸接枝物。

3、在本发明的实施例中，所述氟苯硼酸接枝物为dspe-peg-fpba、dppe-peg-fpba和dope-peg-fpba中的一种或多种，优选为dspe-peg-fpba；所述氟苯硼酸接枝物中peg链段分子量优选为1000-3000。

4、在本发明的实施例中，所述糖响应脂质体制备原料中，磷脂类物质、胆固醇和氟苯硼酸接枝物的质量比为40:10:1～4。

5、本发明提供一种糖响应脂质体制剂，包括：前文所述的糖响应脂质体，以及其包载的免疫调节剂，所述免疫调节剂优选为apy29。具体地，所述糖响应脂质体制剂中免疫调节剂的释放率和糖浓度成正相关。

6、本发明提供一种用于糖尿病环境下骨再生的取向电纺膜，包括取向纳米纤维支架及其复合的自组装物质，所述自组装物质由胶原蛋白和前文所述的糖响应脂质体制剂形成；所述胶原蛋白优选为i型胶原蛋白。

7、在本发明的实施例中，所述取向纳米纤维支架的材质为pla、pcl和pcla中的一种或多种，优选为pla。

8、在本发明的实施例中，所述取向纳米纤维支架的平均纤维直径为0.8-1.3μm，所述取向电纺膜具有亲水性，水接触角优选为32°-100°，更优选为35-80°。

9、本发明提供一种用于糖尿病环境下骨再生的取向电纺膜的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、通过静电纺丝工艺制备不同取向的纳米纤维，收集得到取向纳米纤维膜；通过反向蒸发方式，制备得到前文所述的糖响应脂质体制剂；

11、s2、将所述糖响应脂质体制剂和胶原蛋白溶液混合后置于所述取向纳米纤维膜上，通过自组装得到所述的取向电纺膜。

12、在本发明的实施例中，步骤s2中，所述胶原蛋白溶液为中性，溶质为i型胶原蛋白；所述自组装的温度为35-38℃，时间在30分钟以上。

13、参见图1和图2，本发明实施例为解决在糖尿病病理环境下慢性炎症微环境对骨膜修复的不利影响以及血糖波动对成骨微环境动态调整的关键问题，设计制备了一种具有葡萄糖响应基团的脂质体表面修饰材料，以及胶原蛋白自组装和静电纺丝，以逐步构建仿生微环境响应纤维修复材料。第一方面，图1中示意了糖响应脂质体及其制备，时序调控免疫及成骨成血管复合体系的构建，包括利用脂质体的表面修饰糖响应基团和一型胶原自组装策略进行搭建的技术方案。第二方面，图2示意了功能表征验证，本发明实施例验证了该复合材料体系调控免疫及成骨成血管的能力，以及该体系在糖尿病大鼠骨膜缺损中的治疗效果。

14、病理性糖尿病微环境由葡萄糖波动和慢性炎症组成，导致骨膜缺陷的愈合延迟。因此，有必要开发有利于骨整合并适合在糖尿病复杂微环境中使用的新材料。本技术研究了一种新型葡萄糖反应性纤维支架复合材料，该复合物可调节局部免疫微环境并促进骨膜-植入界面的骨整合。

15、其中，基于微/纳米颗粒的葡萄糖响应药物递送系统是有前途的治疗药物递送策略。例如，脂质体已被赋予刺激反应特征，可以触发封装药物分子的完全释放。当脂质体表面膜变得多孔时，脂质体的内容物开始渗漏，这反过来又导致膜张力进一步降低并最终破裂。在dm微环境中，高葡萄糖浓度可以促进内源性刺激并改变脂质体的结构状态。苯硼酸(pba)是一种常见的葡萄糖响应组分，除了易于以低价制备外，还具有良好的结构稳定性和柔韧性。此外，pba可以与葡萄糖1,2或1,3位的羟基结合，形成动态硼酸盐结构。该反应导致pba分子带负电荷。这个负电荷赋予了pba进一步的化学性质和反应能力，使其具有修饰带正电荷的脂质体的潜力。然而，由于在不同酸度下形成的硼酸结构多种多样，其中pba的pka范围为7.8至8.6，通过这种改性方法形成的硼酸盐的稳定性性较差。更具体地说，在生理环境(ph 7.4<pka，人体的中性环境)中，pba转变为不带电的平面结构，难以与羟基反应，不太容易与葡萄糖结合。这导致葡萄糖硼酸盐变得不稳定且容易水解，从而引起低葡萄糖反应性。

16、与此相比，本发明提供了一种表面修饰有葡萄糖响应基团的脂质体材料，该脂质体结构中修饰了氟苯硼酸接枝物(含-fpba)。在本技术中，在pba中引入了亲电基团以生成pka还原为7.2的4-氟苯基硼酸(fpba)。使用这种策略，葡萄糖和fpba结合产生的负电荷会导致fpba从疏水性变为亲水性。因此，葡萄糖都应与脂质体膜上的fpba单元结合，这将导致膜的结构转变和膨胀。最终，脂质体应该释放负载的药物或其他因子。

17、本技术实施例采用磷脂或胆固醇接枝fpba的物质(即磷脂对氟苯硼酸接枝物或胆固醇对氟苯硼酸接枝物)，与脂质体制备原料直接制备所述的糖响应脂质体，从而使fpba基团作为修饰基团修饰脂质体。进一步地，本技术选择将fpba和磷脂酰乙醇胺类-聚乙二醇结合为pe-peg-fpba，作为修饰脂质体的修饰基团；优点在于，该修饰技术较为成熟，修饰后的脂质体材料较为稳定，不会影响脂质体装载药物制剂等。

18、脂质体(liposome)是一种人工膜；在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体。脂质体的药剂学定义：系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。所述的脂质体制备原料包括磷脂类物质和胆固醇；胆固醇可以加固脂质双分子层膜，降低膜流动，可减小渗漏率。其中，磷脂类物质包括天然磷脂和合成磷脂，天然磷脂以卵磷脂(磷脂酰胆碱，pc)为主，显中性，合成磷脂如dspe(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，dppe(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、dope(二油酰磷脂酰乙醇胺)等。

19、本技术实施例采用磷脂类物质、胆固醇和氟苯硼酸接枝物(如dspe-peg-fpba)，以及可选地免疫调节剂等药物或其他因子，优选通过反向蒸发制备葡萄糖响应性脂质体或其药物制剂形式。更具体地说，卵磷脂，胆固醇和dspe-peg2k-fpba(市售)按一定比例溶解在三氯甲烷，然后将所得溶液与含有十八胺(也可含有特异性免疫调节剂apy29，市售)的三氯乙烷混合。将所得溶液进一步超声混合，得到均匀的乳液。可用旋转蒸发器除去有机溶剂得到胶体产物；最后，进行水合处理以制备脂质体乳液；脂质体乳液通过使用450nm和220nm聚碳酸酯膜超声和过滤，获得相应的葡萄糖响应性脂质体材料。脂质体结构的要求是粒径较为均匀，制备成单室结构的脂质体；若为多室结构脂质体会导致脂质体响应性下降，影响治疗效果。

20、其中，dspe-peg2k-fpba也可用dppe-peg-fpba、dope-peg-fpba替代；所述氟苯硼酸接枝物中peg链段分子量优选为1000-3000，更优选为2000。所述的磷脂类物质、胆固醇和氟苯硼酸接枝物的质量比优选为40:10:1～4；可由卵磷脂、胆固醇、十八胺和dspe-peg2k-fpba制备空白的脂质体材料，如果加入免疫调节剂apy29等药物或其他因子，则形成糖响应脂质体制剂。

21、在本技术的实施例中，所述的糖响应脂质体制剂膜内装载有免疫调节剂apy29，整体外部呈纳米球形貌，表面修饰有fpba接枝结构；apy29是一种高效、选择性的ire1α小分子调节剂，结构式如下。

22、

23、在本技术的实施例中，通常要求脂质体的药物包封率达80％以上。所述糖响应脂质体制剂中免疫调节剂的释放率和糖浓度成正相关，在高糖浓度下72小时药物释放量可达80％，而同期低糖则只有20-30％。

24、静电纺丝因其与天然细胞外基质(ecm)的相似性，而被广泛用于复制指导细胞命运和调节组织再生的生理微环境。由于功能性静电纺丝可以自主响应外部刺激并积极微调治疗化合物的递送，静电纺丝被认为是骨膜再生的良好候选者。调节局部免疫微环境和间充质干细胞的原位成骨细胞分化，对于糖尿病骨缺陷至关重要。本技术在此考虑用特异性免疫调节剂(apy29)加载脂质体，并与i型胶原蛋白(coli)结合进行自组装。为了实现这一目标，采用具有葡萄糖响应基团的脂质体表面修饰，以及胶原蛋白自组装和静电纺丝，以逐步构建仿生微环境响应纤维复合体系。

25、本技术实施例提供了一种用于糖尿病环境下骨膜再生的时刻免疫调节和骨血管再生的取向电纺膜，该新型的纤维膜包括：取向纳米纤维支架及其复合的自组装物质，所述自组装物质由i型胶原蛋白和前文所述的糖响应脂质体制剂形成。该纺丝膜表面的脂质体修饰的fpba基团有望响应高葡萄糖环境，导致脂质体膜亲水性的变化，外膜肿胀增加，脂质双层的破坏将导致包封的apy29的释放；随后，释放的apy29使巨噬细胞向m2表型极化，并诱导成骨和血管生成相关因子的分泌。本技术所述的有序静电纺丝支架将具有多种功能，例如葡萄糖反应，骨免疫调节，骨诱导和血管生成。

26、本技术实施例以取向纳米纤维膜作为纤维支架材料，可通过静电纺丝工艺制备不同取向的纳米纤维，收集得到取向纳米纤维膜。纺丝膜作为细胞生长的平台和载体，具体是选择有序纺丝好还是无序纺丝好是一个难点。通常条件下，纺丝膜默认是无序纺丝，但是无序纺丝作为细胞载体的力学性能稍弱，对细胞的生长形态干预较弱，细胞不太容易在纺丝膜表面生长。因此，本技术选择力学性能更好的有序纺丝，且有序纺丝膜可以影响细胞形态，如引导巨噬细胞向长梭形的m1形态转换，这将更有利于细胞的生长和巨噬细胞表型转换。

27、具体地，本发明实施例将pla等纺丝聚合物溶于二氯甲烷(dcm)和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中；采用常规的静电纺丝设备，如将形成的静电纺丝溶液插入长10厘米、直径0.9毫米的注射器中，用于制备不同取向的纳米纤维支架膜材料。作为优选，所述静电纺丝的推进泵速度为60-80μl·min-1，在15-20kv时，针尖和平行电极接收器(parallel electrodereceiver)之间的距离为10-20cm，可在电极棒之间收集平行取向的纳米纤维膜支架。

28、制备电纺膜的高分子物质是带羧基的聚乳酸类(pla-cooh)，属于特殊的高分子材料。选择pla-cooh的原因是想提高纺丝膜和胶原之间的作用力；普通pla表面并无o、n等吸电子基团，而pla-cooh则有明确的羧基，其o基团有较强的吸引电子的性能，可以和一型胶原表面的h发生氢键间的相互吸引，增强两者之间的作用力。本发明实施例所述取向纳米纤维支架的材质为聚乳酸(pla)、聚己内酯和己内酯/丙交酯共聚物中的一种或多种，优选为pla。聚乳酸又称聚丙交酯，是以乳酸为原料聚合而成的聚酯，是一种无毒、无刺激的合成高分子材料。聚己内酯是己内酯单体开环聚合而成的聚合物，具有良好的生物相容性等。示例地，pla的mw可为109–150kda；所制备的取向纳米纤维支架的平均纤维直径优选为0.8-1.3μm。在本方案中，纺丝膜纤维直径大约在1μm左右，较一般纤维膜相比属于偏粗，目的在于想提高纺丝膜力学性能，后期植入动物模型体内可以有一个更好的力学支撑；纺丝膜厚度要适当，太厚太薄疗效都会下降。

29、本发明实施例进行功能膜的构建：将所述糖响应脂质体制剂和胶原蛋白溶液混合，然后置于所述取向纳米纤维膜上，通过自组装得到所述的取向电纺膜。本发明实施例主要利用自组装水凝胶将脂质体制剂载至静电纺丝膜表面，相对于高压电喷射、乳液制备等破坏脂质体结构，本发明工艺方法条件相对简单，制备期间不会破坏脂质体的结构和稳定性。

30、在用coli和制备的脂质体制剂对膜支架进行功能化之前，本发明还包括对取向纳米纤维膜灭菌，如用75％乙醇灭菌，之后用水(通常为去离子水)冲洗以除去任何残留的乙醇。本发明实施例可将冻干的一型胶原(collagen i)溶解在乙酸水溶液中，并在4℃下储存，直到需要进一步使用。在冰浴中，稀释的一型胶原溶液用pbs(10×)以6：1的比例稀释，并用naoh(0.1m)水溶液将稀释溶液ph调节至7.0。然后，本发明实施例将上述制备的脂质体制剂加入中和胶原蛋白溶液中，充分搅拌并置于静电纺丝膜上。最后，本发明实施例可将样品置于35-38℃的培养箱中，放置30分钟以上进行自组装，洗涤即得。i型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物(皮、骨和鳞)含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80％～90％左右，在医学上的应用最为广泛。ⅰ型胶原呈棒状，由三条肽链组成，其分子中的氨基可与脂质体分子中的羟基结合；本发明实施例所用的sigma的大鼠一型胶原，可为300kd，但并不局限于此，例如为200kd～350kd等。本发明实施例将上述的脂质体制剂与i型胶原混合后进行自组装，所形成的水凝胶状态一定程度上满足了将脂质体修饰至静电纺丝膜表面的流变性等要求。如果单独液态的胶原在植入体内后会四处分散，无法长效作用于骨缺损的表面，影响骨修复效果。本发明实施例所述的取向电纺膜具有一定的亲水性，所复合的自组装物质在膜表面分布均匀。

31、在本发明的一些实施例中，所述的脂质体和一型胶原的质量体积比可为15.6：100(15.6μg的脂质体溶在100μl的一型胶原溶液里)，可以有效自组装；加载到取向纤维膜上的比例就是15.6：100(w/v)，在15～16：100(w/v)范围之间即可，所加入的脂质体会稍微减弱一型胶原自身的组装，但总体影响不大。

32、通过图2所示该体系在治疗糖尿病大鼠骨膜缺损的研究发现，本技术实施例的pcla等取向电纺膜通过阻断ireα/nod-like/nfκb信号通路，将病理性糖尿病微环境重塑为再生微环境，同时重新编程巨噬细胞从m1向m2表型的转变，增强成骨分化和血管生成。总的来说，获得的发现表明，pcla调节免疫微环境并增强糖尿病患者骨膜缺陷的骨整合。此外，本研究为设计用于糖尿病患者骨再生治疗的功能化生物材料提供了一种有效的策略。