一种纳米工程化红细胞的制备及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种纳米工程化红细胞的制备及其应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒在感染期间的一个关键事件中，sars-cov-2的刺突糖蛋白（spikeglycolprotein，s蛋白）与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2（angiotensin convertingenzyme 2，ace2）受体结合，导致病毒包膜和宿主细胞膜融合。ace2受体也是其他冠状病毒（如sars-cov、h1n1、h5n1和hcov-nl63等）的共享受体。s蛋白有s1和s2两个亚基，其中s1含有一个特异性识别ace2受体的受体结合区域（receptor binding domain，rbd）。sars-cov-2在s1/s2边界进化出一个多碱基位点，该位点被弗林蛋白酶（furin）裂解，导致s1解离，s2被s2’位点的跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane serine proteinase 2，tmprss2）进一步裂解，这是进一步的病毒和细胞膜发生膜融合所必需的。然后，病毒通过以下两种途径之一进入细胞：tmprss2介导的质膜融合途径和组织蛋白酶（cathepsin l，ctsl）介导的内吞途径。因此，弗林蛋白酶、tmprss2和ctsl的酶活性以及ace2受体结合对于冠状病毒进入宿主细胞是必要的。

2、sars-cov-2在入侵宿主细胞后便开始大量复制，其中以遗传物质rna基因组的转录和复制两个过程为核心。遗传物质的转录将最终经过翻译形成新生病毒的结构组成蛋白质，而其复制将形成新生病毒的rna基因组。病毒rna依赖的rna聚合酶（rna-dependent rnapolymerases，rdrp），也被称为第12号非结构蛋白（non-structural protein 12，nsp12），能够与其他多个非结构蛋白质组装形成一台高效的rna合成“机器”，完成这两大过程。rna聚合酶作为转录复制机器的核心部件，是最重要的抗病毒药物靶标之一，破坏其功能预期将能够阻止病毒的复制，最终达到治疗的目的。目前，应对sars-cov-2有预防和治疗两个方面，其中预防以疫苗为主，治疗主要分为三种，分别为靶向rna聚合酶的抗病毒药物、靶向受体结合域（rbd）的中和抗体以及针对病毒引起的炎症风暴而采取的免疫调节手段。其中大家耳熟能详的瑞德西韦（gs-5734）、法匹拉韦（t-705）、利巴韦林就是作用于上述靶点。然而，病毒rna聚合酶具有相对较高的聚合错误率，并且缺乏校对能力，这可能导致病毒发生突变和随后的耐药性。目前，在全球范围内新型冠状病毒变异毒株已超1000种，新型冠状病毒属于rna病毒，作为最大最复杂的rna病毒，冠状病毒拥有长达32000个核苷酸组成的基因组，这为新型冠状病毒的变异创造了得天独厚的条件。新变种的出现会导致最初研发的中和抗体效力下降。因此，亟待开发一种广谱抗病毒方法，以加强对当前和未来冠状病毒相关疾病的管理。值得注意的是，在病毒复制和广泛变异之前阻止冠状病毒进入宿主细胞是更有前景的治疗策略之一。尤其是当发现新的病毒，并且没有有效的治疗和疫苗接种时，这具有很高的治疗价值。在病毒感染周期的早期阶段，精确抑制宿主ace2+肺细胞中的这些关键蛋白酶可以阻止s蛋白的激活、其与宿主细胞膜的融合以及随后进入细胞。通过药物干预实现这一目标的主要挑战之一是需要确保药物精确递送到ace2+细胞，因为这些酶（弗林蛋白酶、tmprss2和ctsl）发挥着重要的生理作用，如果通过全身给药的方式，会带来对机体正常生理活动的严重干扰。

3、纳米材料在诊断测试、疫苗研发、病患治疗等方面具有重要的作用。多种临床研究使用纳米颗粒为载体，包裹和递送有效治疗的药物进行精准递送和靶向。随着纳米材料的快速发展，中空介孔二氧化硅（hollow mesoporous silica nanoparticles，hmsn）作为一种新型的纳米治疗工具逐渐进入人们的视野。相比于普通的介孔二氧化硅（mesop-oroussilica nanoparticles，msn），hmsn无论在载药容量或者联合用药方面都有很大提升，并且其安全性很高，被美国食品药品监督管理局（food and drug administration，fda）认证可以作为化妆品和食品添加剂使用。但由于体内输送屏障—单核巨噬细胞系统（mononuclearphagocyte system，mps）摄取了超过95%静脉注射的纳米粒子，纳米医学的潜力尚未完全发挥出来，无法有效实现器官靶向。

4、近年来兴起的“红细胞搭便车技术”是一种新型的肺部特异性靶向药物运输技术，是指构建的载药纳米载体（ncs）通过氢键和/或静电相互作用与完整的红细胞（rbc）结合，而不是仅仅只用提取的红细胞膜包裹纳米载体。作为静脉注射纳米载体-rbcs复合物后遇到的第一个器官，远端肺毛细血管的压缩和变形将触发ncs从rbcs上释放。这种方法不仅可以实现有效的肺部靶向，还可以防止大多数载药ncs被肝脏和脾脏中的巨噬细胞吞噬。

技术实现思路

1、本发明的目的为抑制sars-cov-2入侵宿主细胞（即肺部细胞）。

2、本发明首先保护联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda的制备方法，可包括如下步骤：

3、（a1）将hmsn纳米粒、酶抑制剂camostat和酶抑制剂e-64d混合，避光搅拌12h以上（如12-18h、18-24h、12h、18h或24h），离心，收集并洗涤沉淀1；

4、（a2）重悬沉淀1，之后加入pda，避光搅拌12h以上（如12-18h、18-24h、12h、18h或24h），离心，收集并洗涤沉淀2；

5、沉淀2即为联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda。

6、上述方法中，所述步骤（a1）中，所述洗涤为用无菌水洗涤。所述洗涤的目的可为洗去未装载的酶抑制剂。

7、上述方法中，所述步骤（a2）中，所述重悬为用tris-hcl缓冲液重悬；所述洗涤为用pbs缓冲液洗涤。

8、上述方法中，所述步骤（a1）中，hmsn纳米粒可以以hmsn纳米粒沉淀的形式加入。hmsn纳米粒沉淀的制备方法可为：用无菌水重悬hmsn纳米粒，之后超声清洗至弥散，离心，收集沉淀。

9、上述方法中，所述步骤（a1）中，hmsn纳米粒、酶抑制剂camostat和酶抑制剂e-64d的质量比可为10mg：（1-1.5）mg：（1-1.5）mg（如10mg：（1-1.25）mg：（1-1.25）mg、10mg：（1.25-1.5）mg：（1.25-1.5）mg、10mg：1mg：1mg、10mg：1.25mg：1.25mg或10mg：1.5mg：1.5mg）。

10、上述方法中，所述步骤（a1）中，“将hmsn纳米粒、酶抑制剂camostat和酶抑制剂e-64d混合”可为将hmsn纳米粒、酶抑制剂camostat和酶抑制剂e-64d在无菌水中混合。

11、上述方法中，所述步骤（a2）中，重悬沉淀1之后加入pda之前还可进行超声步骤。即将沉淀1用tris-hcl缓冲液重悬并超声，之后加入pda。

12、上述方法中，hmsn纳米粒和pda的比例可为10mg：（4-6）mg（如10mg：（4-5）mg、10mg：（5-6）mg、10mg：4mg、10mg：5mg或10mg：6mg）。

13、采用上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda也属于本发明的保护范围。

14、本发明还保护联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2的制备方法，可包括如下步骤：将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda和anti-ace2混匀，20-30℃（如20-25℃、25-30℃、20℃、25℃或30℃）反应1h以上（如1h、2h或3h），得到联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2。

15、上述方法中，所述将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda和anti-ace2混匀可为在pbs缓冲液中将联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda和anti-ace2混匀。

16、上述方法中，anti-ace2的加入形式可为anti-ace2溶液；anti-ace2溶液的浓度可为300-500μg/ml（如300-400μg/ml、400-500μg/ml、300μg/ml、400μg/ml或500μg/ml）。

17、采用上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2也属于本发明的保护范围。单细胞测序表明ace2在0.64%的肺细胞中表达，且80%以上都集中表达于ii型肺泡细胞。所以肺泡中占ii型肺泡上皮细胞总数量1.4%的ace2+细胞是新型冠状病毒在肺部的真正靶细胞，基于此，发明人将ace2抗体偶联在pda表面，来实现精准治疗。

18、本发明还保护纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs的制备方法，可包括如下步骤：

19、（b1）将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2与红细胞以200-5000个纳米粒子：1个红细胞（如200-1000个纳米粒子：1个红细胞、1000-3000个纳米粒子：1个红细胞、3000-5000个纳米粒子：1个红细胞、200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞）的比例混匀，2-6℃（如2-4℃、4-6℃、2℃、4℃或6℃）反应2h以上（如2h、4h、6h或8h）；

20、（b2）完成步骤（b1）后，离心并洗涤，得到纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs。

21、上述方法中，所述将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2与红细胞以200-5000个纳米粒子：1个红细胞的比例混匀可为在pbs缓冲液中将联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2和红细胞混匀。

22、采用上述任一所述制备方法制备的纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs也属于本发明的保护范围。

23、本发明还保护上述任一所述联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda的应用，可为c1）或c2）或c3）：

24、c1）制备纳米工程化红细胞；

25、c2）制备所述联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2；

26、c3）制备所述纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs。

27、本发明还保护上述任一所述联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2的应用，可为d1）或d2）或d3）或d4）或d5）：

28、d1）阻断新型冠状病毒感染细胞；

29、d2）阻断新型冠状病毒感染肺部细胞；

30、d3）制备纳米工程化红细胞；

31、d4）制备所述纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs；

32、d5）制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的产品。

33、本发明还保护上述任一所述纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs的应用，可为e1）或e2）：

34、e1）阻断新型冠状病毒入侵肺部细胞；

35、e2）制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的产品。

36、本发明提供了联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2和该联合载药纳米粒修饰的纳米工程化红细胞，并在新型冠状假病毒体外感染模型和人源化小鼠模型中进行了治疗及效果评估。具体如下：（1）本技术的发明人首先构建单独和联合载药纳米粒：分别以萘基荧光素（naph）、肽基氯甲基酮（cmk）、六-d-精氨酸酰胺（hexa-d-arginine）、抑肽酶（aprotintin）、卡莫司他（camostat）和阿洛司他丁（e-64d）为候选药物，装载进hmsn中，得到5种单独载药纳米粒；联合药物治疗已应用于临床的各个领域，多靶点混合药物越来越受到发明者们的关注，筛选出camostat和e-64d两种酶抑制剂后，发明人也构建了联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda。（2）发明人对载药纳米粒在新型冠状假病毒体外感染模型中的阻断效果进行了验证，结果表明，新型冠状假病毒体外感染模型中筛选出阻断效果最佳的治疗性纳米粒为联合载药纳米粒camostat+e64d@hmsn@pda。（3）构建了治疗性的“赋能”红细胞，即将筛选出的联合载药纳米粒camostat+e64d@hmsn@pda与红细胞进行非共价结合，并对联合载药纳米粒camostat+e64d@hmsn@pda的血液相容性进行了检测，血清稳定性实验验证了其在体内正常血管中能够保持在比较高的负载率，同时，扫描电镜也观察到纳米粒有效负载在红细胞上，由此可见，成功构建了治疗性的“赋能”红细胞。（4）本发明对小鼠进行新型冠状假病毒给药，之后尾静脉注射纳米工程化红细胞camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2+rbcs，采用生物发光成像检测全身luc表达判定ace2表达，荧光发光成像检测判定治疗效果，并对小鼠肺部以及其它脏器行病理生理学检测分析。结果表明，联合载药纳米粒camostat+e-64d@hmsn@pda-anti-ace2修饰的纳米工程化红细胞可以精准靶向阻断新型冠状病毒入侵肺部宿主细胞且对脏器无损伤。

37、本技术的发明人创新性的首次建立了一种新型的广谱的抗病毒策略，即通过红细胞搭便车技术输送装载有抑制病毒入侵的关键酶的抑制剂的载药纳米粒（本技术中称之为“纳米工程化红细胞”），精准靶向肺部组织ace2+细胞释放抑制病毒入侵的关键酶，实现抑制sars-cov-2入侵宿主细胞的目标。该策略与sars-cov-2是否发生基因变异无关，因为目前来看，无论sars-cov-2如何变异，其入侵宿主细胞的所需要的宿主细胞参与的酶是不变的。本发明具有重要的应用价值。