一种环境适应型动态水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及本发明涉及一种环境适应型动态水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、腰痛是现代社会最常见的骨及肌肉疾病，其中椎间盘退变是造成腰痛的主要原因之一，是一种与年龄相关的慢性疾病，常导致人群活动障碍和劳动力丧失，给社会经济和医疗保健带来巨大的负担，目前临床上仍然缺乏逆转椎间盘退变病程的有效治疗手段。髓核组织位于椎间盘中心，对于维持椎间盘生理及力学功能至关重要，恢复髓核的功能是治疗椎间盘退变的一种理想方法。因此，如何维持椎间盘的力学功能并同时恢复髓核组织的生理功能是治疗椎间盘退变的首要问题之一。

2、水凝胶是生物医药领域的新型材料，具有良好的生物相容性，可塑性和可降解等性质，还能搭载并释放药物，是修复损伤组织的的理想材料之一。但通常水凝胶交联后结构固定，常与体内各种复杂的生物结构相去甚远，导致治疗效果下降。而环境适应型动态水凝胶是一种适用于组织再生的新型智能水凝胶，具有可逆交联的特性，可以通过组织微环境驱动水凝胶内部发生物理或化学变化，释放功能因子或改变水凝胶交联程度，从而对水凝胶的性能进行环境适应性重编程，最终达到更好的组织重建效果。

3、水凝胶是亲水性聚合物链的网络，有时也叫做胶体凝胶，其中水是分散介质。三维软体是由于亲水性聚合物链通过物理或化学交联而保持在一起。由于固有的交联，水凝胶网络的结构完整性不会因高浓度的水而溶解。普通的水凝胶是通过各种共价键进行交联，是不可逆的，因此微观结构通常是固定的，在复杂的体内环境常遭到破坏并且难以恢复，不利于组织的机械支撑。并且细胞会通过静态和动态机械信号的组合与周围环境相互作用，不良的细胞外基质环境还会限制其生长及功能，因此非动态水凝胶结构的治疗效果是有限的。

4、动态水凝胶是包含多动态键(酰腙键、亚胺键、氢键等)的水凝胶，动态键具有的优异的自愈合性能，可以通过注射的方式填充到椎间盘靶部位，随后水凝胶包含的动态键快速重组，重建其内部凝胶样结构，为后续组织修复提供力学支撑。此外，其还能根据退变后椎间盘微环境的酸性以及有害的亚铁离子增多的特征重编程水凝胶内部网络结构并释放药物，从而增强在结构和药物上的持久治疗作用，进而调节相关细胞行为，为椎间盘组织修复提供合适的条件。

5、髓核内部力学以及理化环境复杂，非动态水凝胶常常收到破坏并导致治疗效果下降，动态水凝胶能自愈合，从力学和药物释放两方面改善椎间盘微环境和细胞行为，促进椎间盘的组织重建，以治疗椎间盘退变。

6、因此，本发明制备了一种受椎间盘微环境成分调控性能的环境自适应动态水凝胶，用于改善髓核微环境延缓椎间盘退变进程。

技术实现思路

1、本发明首先提供了一种环境适应型动态水凝胶，所述水凝胶包含oha、pva和四硼酸钠；以及nmo或gdf-5。

2、优选的，所述nmo的制备方法包括：采用脂质体挤出法通过重复挤出提取髓核细胞膜(纳米囊泡nm)，将提取的nm与ori在脂质体挤出机中以2:1的体积比混合，通过重复挤出形成nmo。

3、优选的，所述氧化透明质酸(oha)的合成方法：将10mg透明质酸(ha)溶解在100ml蒸馏水中，随后加入20mm高碘酸钠；将混合物避光搅拌24小时；之后，将混合物在暗处中透析(透析袋mw 3500da)3天，并在真空下干燥以获得用于后续实验的含有醛基的氧化透明质酸(oha)。

4、优选的，所述oha浓度为5-15mg/ml，所述pva浓度为5-15％w/v，所述四硼酸钠浓度为0.5-1.5％w/v。

5、优选的，所述oha浓度为10mg/ml，所述pva浓度为10％w/v，所述四硼酸钠浓度为1％w/v。

6、本发明还提供一种环境适应型动态水凝胶的制备方法，包含以下步骤：(1)负载ori的纳米囊泡(nmo)的制备及检测；(2)水凝胶前体即氧化透明质酸(oha)的制备及检测；(3)动态水凝胶的制备及检测。

7、优选的，所述nmo的制备包括：采用脂质体挤出法通过重复挤出提取髓核细胞膜(纳米囊泡nm)，将提取的nm与ori在脂质体挤出机中以2:1的体积比混合，通过重复挤出形成nmo。

8、优选的，所述氧化透明质酸(oha)的制备包括：将10mg透明质酸(ha)溶解在100ml蒸馏水中，随后加入20mm高碘酸钠；将混合物避光搅拌24小时；之后，将混合物在暗处中透析(透析袋mw 3500da)3天，并在真空下干燥以获得用于后续实验的含有醛基的氧化透明质酸(oha)。

9、优选的，所述动态水凝胶的制备包括：将10mg oha溶解在100ml pbs(ph＝7.4)中以获得10mg/ml oha溶液；同时，在90℃下将1g聚乙烯醇(pva)溶于10ml pbs(ph＝7.4)中以获得10％pva溶液；将300μl 10％pva溶液与700μl oha溶液(10mg/ml)在室温下搅拌混匀；随后将混合物加入1％的四硼酸钠，以在室温下立即引发复合水凝胶的形成，该复合水凝胶被命名为hp；类似地，将gdf5、nmo和gdf5+nmo加入300μl 10％pva溶液和700μl oha溶液(10mg/ml)的混合物中，从而在引入1％四硼酸钠后分别形成hpg、hpo和hpgo水凝胶。

10、本发明还提供一种环境适应型动态水凝胶或环境适应型动态水凝胶制备方法的应用，所述应用为a)制备用于生物工程试剂或试剂盒；或b)制备椎间盘组织修复或组织重建试剂或试剂盒；或c)制备治疗椎间盘的药物；或d)恢复髓核细胞的功能方法，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的。

11、本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

12、本发明负载ori的纳米囊泡(nmo)的有益效果：冬凌草甲素(ori)是一种在传统中草药中发现的天然萜类化合物，具有强大的抗炎作用，引起了人们对idd治疗的极大兴趣。然而，其固有的疏水性严重限制了临床应用。为了应对这一挑战，我们采用脂质体挤出法通过重复挤出提取髓核细胞膜(nm)，并将其用于制备ori负载的纳米囊泡，预计这将促进ori的掺入，同时使其能够向炎症环境中的髓核细胞进行同源递送。

13、水凝胶前体即氧化透明质酸(oha)的有益效果(即水凝胶骨架的有益效果)：目前大多数动态水凝胶设计具有较低的机械弹性，经承受过多机械应力后常导致水凝胶过早断裂和ivd再生不足。本发明设计了一种基于pva，oha为骨架的水凝胶，oha与pva能够建立各种动态键来为退化的椎间盘提供机械支持，并能够防止水凝胶过早破裂。

14、水凝胶整体的有益效果：在四硼酸钠的作用下在将包括oha-gdf5、nmo和pva的水凝胶前体注射入椎间盘就能产生含有更多动态键的能自愈合的hpgo，在为椎间盘提供机械支持的同时也作为局部药库缓慢地释放gdf-5和nmo。除此之外，由于hpgo丰富的席夫碱基团形成了能够吸附游离二价铁分子的分子网络，而过多的游离二价铁是椎间盘退变的生理特点之一，并且hpgo在吸附椎间盘过量的亚铁离子后还能显著提高hpgo的交联水平，增强其机械弹性，提高其对ivd中压缩载荷的抵抗力。本水凝胶能将药物释放；并且治疗效果良好；最后在支撑能力上，还有自愈合的效果。