同时破坏HBB竞争和HBG表观沉默在治疗β-血红蛋白病中的应用

本发明属于生物医学，具体涉及同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默在治疗β-血红蛋白病中的应用。

背景技术：

1、在人的发育过程中，伴随着造血位点的迁移，红细胞中血红蛋白的主要类型从胎儿血红蛋白(hbf,α2γ2)向成年型血红蛋白(hba,α2β2)发生改变。这种从γ-珠蛋白(hbg)向β-珠蛋白(hbb)的转录改变的过程被称为γ-向β-珠蛋白表达转换。hbb的突变导致的β-血红蛋白病(主要包括β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血症)，是世界上公认的最大的单基因遗传病，给公共健康带来了巨大的负担。在成年期激活hbf可以缓解β-血红蛋白病的临床症状，并成为该疾病的潜在的治疗方法。因此，对于γ-向β-珠蛋白表达转换中主要由bcl11a介导的hbg的表观沉默得到了大量的研究。以往研究已经实现了γ-向β-珠蛋白表达转换的部分逆转，理论上最高可提升hbf到约60％的水平。

2、然而，γ-向β-珠蛋白表达转换是否能够被完全逆转仍然未知。虽然在γ-向β-珠蛋白表达转换中发现了基因竞争和自主沉默现象，但是其调控机制仍然不清楚。作为超级增强子的基因座控制区(locus control region，lcr)增强珠蛋白基因表达是以形成染色质环的形式发挥调控功能，这样可使lcr与珠蛋白基因形成物理上的靠近。在珠蛋白基因表达转换中发生染色质构象的改变，而且lcr在一个时间点只能与一个珠蛋白基因启动子发生作用。γ-与β-珠蛋白基因间竞争结合lcr决定了珠蛋白基因的表达模式。很多证据显示hbg与lcr间相互作用的增强可减弱hbb与lcr间的相互作用，并伴随着β-珠蛋白表达的下降。

3、本发明通过破坏hbb与lcr间的相互作用的同时解除hbg上的表观沉默首次实现了γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转。该发现为γ-向β-珠蛋白表达转换提供了重要的深入了解，为操纵该过程提供了新方法，并为β-血红蛋白病提供了新的治疗策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默在治疗β-血红蛋白病中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默的试剂在制备用于治疗β-血红蛋白病的药物中的应用；

4、所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默是通过破坏hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件来实现的。

5、进一步，所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默是通过对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现的。

6、进一步，所述突变的类型包括缺失、替换、插入、倒置、重复和/或易位突变；

7、优选地，所述缺失突变包括移除hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基；

8、优选地，所述替换突变包括将hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基替换为其它碱基；

9、优选地，所述插入突变包括在hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的任意位置插入一个或多个碱基；

10、优选地，所述倒置突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基位置的颠倒；

11、优选地，所述重复突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基的重复；

12、优选地，所述易位突变包括hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件中的一个或多个碱基从一个位置移动到另一位置。

13、进一步，所述缺失突变为将hbb启动子上的caccc元件突变为cac、cc、cacc、c、accc、ccc、cacccc、caaccc、cactcc、cacacattggcc、cactc、cact或caccc元件的全部缺失中的任意一种，将hbg启动子上的tgacca元件突变为tgaca、tgaa、tgac、tga、tg、cca、t、ca、a、tgatcca、tgacaaggctattgcca、tgaacca、tgaa或tgacca的全部缺失中的任意一种；

14、优选地，所述替换突变为将hbb启动子上的caccc元件突变为taccc、catcc、cactc、cacct、tatcc、tactc、tacct、cattc、catct、cactt、tattc、tatct、tactt、cattt或tattt中的任意一种，将hbg启动子上的tgacca元件突变为taacca、tgatca、tgacta或tgatta中的任意一种。

15、进一步，所述缺失突变可应用crispr-cas9基因编辑技术实现，crispr/cas9是一种基于细菌天然免疫机制开发的基因编辑技术。经简化改造的crispr系统由核酸内切酶cas9和grna(guide rna，grna)两部分组成。cas9能识别并结合基因组上的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif，pam)并形成dna双链解旋，此时grna的crrna部分能与pam上游序列成功互补配对，cas9将激活其核酸内切酶活性，在pam上游特定位置形成双链dna断裂(double strand break，dbs)。dbs可激活细胞的dna损伤修复机制，非同源性末端结合(non-homologous end joining，nhej)或同源重组介导的修复(homology directedrepair，hdr)。nhej，即易错修复，会在修复位点引起随机插入或缺失，造成移码突变，使得基因不再表达，由此形成基因敲除。hdr，即精准修复，能借助外源引入的单链或双链dna为模板介导基因替换或插入，这种方式可以将一段dna序列精准地插入特定的基因组位点，由此完成基因敲入或替换。

16、进一步，所述替换突变是采用本领域技术人员所公知的基因编辑技术实现的，所述基因编辑技术包括但不限于：单碱基基因编辑技术、crispr-cas9基因编辑技术。在一些实施方案中，所述替换突变是采用单碱基基因编辑技术实现的，所述单碱基基因编辑技术是指能够在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术，其基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(apobec)或腺苷脱氨酶与现存cas9n(d10a)融合而形成，依赖于crispr原理使得靶点远离pam端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。目前，单碱基基因编辑技术包括两种：嘧啶碱基转换技术(c/g到t/a)、嘌呤碱基转换技术(a/t到g/c)。

17、进一步，所述同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默能够实现γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转。

18、在本发明的具体实施方案中，通过突变hbb上的caccc元件和hbg上的tgacca元件同时破坏了hbb与hbg间的竞争抑制以及hbg上的表观沉默，实现了γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转，并且组合编辑hbb上的caccc元件和hbg上的tgacca元件能够提升hbf表达接近至整个血红蛋白水平的100％，显著高于目前本领域理论上可提升的hbf的最高水平(60％)，该方法为临床上治疗β-血红蛋白病提供了一种精准高效的治疗策略。

19、在一些实施方案中，能够破坏hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件的任何方式均在本发明的保护范围内，包括但不限于对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变这种方式。在另一些实施方案中，对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行的任何突变方式均在本发明的保护范围内，只要能够实现同时破坏hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件这一目的的任何突变方式均落入本发明的保护范围，需要说明的是，并不局限于实施例中进行的示例性的具体突变。

20、本发明的第二方面提供了一种用于治疗β-血红蛋白病的药物组合物。

21、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的试剂；

22、优选地，所述试剂通过同时破坏hbb竞争和hbg表观沉默实现γ-向β-珠蛋白表达转换的完全逆转。

23、进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

24、在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或辅料在remington'spharmaceutical sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性物质的生物有效性等，如此配制得到的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的给药方式将所述药物组合物进行给药。

25、在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或辅料的非限制性实例包括但不限于：防腐剂、化学稳定剂、ph调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。例如，防腐剂包括但不限于：氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、尼泊金、基香草醛、甘油、石碳酸、对氯酚，化学稳定剂包括但不限于：明胶、白蛋白、柠檬酸、苹果酸、碳酸氢钙，ph调节剂包括但不限于：磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液，表面活性剂包括但不限于：阳离子、阴离子、非离子型表面活性剂，例如tween-80，离子强度增强剂包括但不限于：氯化钠、氯化钾、氯化钙。

26、本发明的第三方面提供了一种用于治疗β-血红蛋白病的药物制剂。

27、进一步，所述药物制剂包含本发明第二方面所述的药物组合物。

28、在一些实施方案中，所述药物制剂的剂型包括但不限于：注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、缓释剂、纳米制剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂。

29、在一些实施方案中，本发明所述的药物制剂可采用本领域技术人员熟知的常规制备方法进行制备，如将各有效成分混匀，或者根据各种剂型的常规制备方法，将药效成分与相应辅料混配后制备获得。本发明所述的药物组合物还可与其他能够用于治疗和/或辅助治疗β-血红蛋白病的药物或化合物一起使用。

30、在本发明中，对所述药物组合物或药物制剂的施用方式并无特别限制，在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂的施用方式包括但不限于：注射、输注、滴注或摄取。其中，注射包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑内脊柱和胸骨内注射和输注。

31、本发明的第四方面提供了一种体外非治疗目的地完全逆转γ-向β-珠蛋白表达转换的方法。

32、进一步，所述方法是通过对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现完全逆转γ-向β-珠蛋白表达转换；

33、优选地，所述突变为本发明第一方面中所述。

34、本发明的第五方面提供了一种体外非治疗目的地促进γ-珠蛋白表达、抑制β-珠蛋白表达的方法。

35、进一步，所述方法是通过对hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现的；

36、优选地，所述突变为本发明第一方面中所述。

37、此外，本发明还提供了一种用于治疗β-血红蛋白病的方法，所述方法通过对有需要的受试者骨髓的造血干细胞中hbb启动子上的caccc元件和hbg启动子上的tgacca元件进行突变来实现的，其中，所述突变为本发明第一方面中所述。

38、在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物或非哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。在本发明的具体实施方案中，所述受试者优选为人。

39、在本发明中，所述β-血红蛋白病是指与β-血红蛋白相关的任何疾病或病症，包括但不限于：β-地中海贫血、镰刀型细胞贫血症、镰状细胞性状、血红蛋白c疾病、血红蛋白c性状、血红蛋白s/c疾病、血红蛋白d疾病、血红蛋白e疾病、具有增加的氧亲和力的血红蛋白相关病症、具有降低的氧亲和力的血红蛋白相关病症、不稳定血红蛋白病、高铁血红蛋白症，此外，所述β-血红蛋白病还包括与β-血红蛋白病相关的一种或更多种症状，所述症状包括但不限于：贫血、组织缺氧、器官功能障碍、异常血细胞比容值、低效红细胞生成、异常网织红细胞(红血球)计数、异常铁负荷、环形铁粒幼红细胞的存在、脾肿大、肝肿大、外周血流受损、呼吸困难、溶血增加、黄疸、贫血痛危象(anemic pain crise)、急性胸部综合征、脾隔离症、中风、手足综合征和疼痛如心绞痛。

40、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

41、本发明首次发现破坏hbb与lcr间的相互作用的同时解除hbg上的表观沉默能够完全逆转γ-向β-珠蛋白表达转换。该发现为珠蛋白表达转换提供了全面阐述，并为β-血红蛋白病提供了新的治疗策略，具有良好的临床应用前景。