一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂及其制备方法和应用

本发明属于药物制剂领域，更具体的说是涉及一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、水痘-带状疱疹病毒(vzv)是一种嗜神经性病毒，在引起感染后可潜伏于机体神经节的神经元内，当细胞介导的机体免疫力下降或个体衰老时，病毒再次活化并大量复制，可在周围感觉神经及该神经所支配的单侧皮节发生免疫反应，引起以红斑、簇集分布的水疱以及神经痛为主要特征的带状疱疹(hz)，主要发生于老年人等免疫力低下人群。

2、近年来，接种疫苗成为预防带状疱疹最佳且必要的手段。目前获批上市的带状疱疹疾病相关疫苗可分为带状疱疹减毒活疫苗(msd)和重组亚单位带状疱疹疫苗(gsk)。前者对预防成人带状疱疹和后遗神经痛有效，但在老年人中观察到的保护效果和持续时间有限，且不适用于原发或继发免疫缺陷的患者。后者可以诱导强的ge特异性细胞和体液免疫反应，在两次注射后能够给老年人群提供长达6年的保护，在所有年龄段均发挥了较高的保护作用。然而，重组亚单位带状疱疹疫苗产生的包括注射部位反应和全身反应是常见的，以及as01b佐剂系统中mpl和qs-21的价格很昂贵，这阻碍了它们的进一步应用。

3、重组蛋白抗原成分单纯，不能在体内复制，对宿主没有致病的风险等优势，从而具有较好的安全性和稳定性。目前基于带状疱疹病毒糖蛋白e(vzv-ge)构建的疫苗通常只具有较强的体液免疫反应，但无法诱导较强的细胞免疫。研究发现细胞介导免疫(cmi)在预防潜伏的vzv再活化和传播等方面比体液免疫更有效，具有重要意义。因此，研究能够同时诱导较强的体液和细胞免疫效应的包载vzv-ge蛋白抗原的重组带状疱疹蛋白疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种共包载vzv-ge蛋白抗原和佐剂的脂质体重组带状疱疹蛋白疫苗制剂。本发明以带状疱疹病毒糖蛋白e(vzv-ge)作为抗原，采用薄膜分散法和冷冻干燥法制备脂质体重组带状疱疹蛋白疫苗制剂；该制剂能够显著增强细胞和体液免疫效应，有助于预防带状疱疹的发生。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一技术目的是提供一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的组分包括：vzv-ge、磷脂、冻干保护剂、佐剂；其中，所述抗原占磷脂质量的5～20％，所述冻干保护剂占磷脂质量的2.5～15％；所述佐剂占磷脂质量的0.2～0.8％。

4、具体地，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂由共包载带状疱疹病毒糖蛋白e(vzv-ge)和佐剂的阳离子脂质体复合物和冻干保护剂组成；所述vzv-ge主要通过静电相互作用吸附到复合物表面，所述佐剂吸附于复合物磷脂层或包载于复合物内核，所述冻干保护剂通过分子间相互作用吸附于磷脂外层。

5、优选的，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的外观、复溶能力和复溶后外观均较佳，粒径为300～800nm，pdi为0.2～0.5，vzv-ge的包封率为50～76％，载药量为2.4～3.8％。

6、进一步地，所述磷脂选自1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(dotma)、1,2-双十四酰-锡-甘油基-3-磷酸胆碱(dmpc)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg2000)、胆固醇(chol)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二硬酯酰基磷脂酰胆碱(dspc)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)中的三种；

7、所述水化介质选自ph7.4三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris-buffer)、磷酸盐缓冲液(pbs)、n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙烷磺酸(hepes)中的一种；

8、所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种，所述冻干保护剂的加入方式选自加入空白脂质体(lip+s+ge)、包载vzv-ge重组蛋白的脂质体混悬液(lip+ge+s)、水化介质(lip/s+ge)中的一种；

9、所述佐剂选自单磷酰脂质a(mpla)、α-半乳糖神经酰胺(α-gc)、聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(i:c))中的一种或几种组合。

10、优选的，所述磷脂选自dotma、dmpc、dspe-peg2000按摩尔比5～40:10～20:1组成的混合物；所述冻干保护剂为蔗糖，加入方式为lip+ge+s；所述佐剂选自mpla、α-gc、poly(i:c)；其中，mpla和α-gc吸附于复合物磷脂层，poly(i:c)包载于复合物内核。

11、本发明第二技术目的是提供一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的制备方法，所述制备方法采用薄膜分散法、逆向蒸发法、注入法、冷冻干燥法中的一种或两种联用。

12、优选的，所述制备方法为薄膜分散法和冷冻干燥法联用，具体操作步骤如下：

13、(1)各脂质成分按比例混匀后减压干燥得到脂质体薄膜；

14、(2)加入ph7.4 tris-buffer水化得到空白脂质体混悬液；

15、(3)加入抗原原液，涡旋，孵育制备重组带状疱疹蛋白疫苗混悬液；

16、(4)加入冻干保护剂，脂质体挤出器过膜挤压，预冻，放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到重组带状疱疹蛋白疫苗制剂。

17、优选的，所述步骤(1)、步骤(2)中脂质体成膜温度和水化温度均为25～30℃；所述步骤(3)中抗原孵育条件为室温；所述步骤(4)中碳酸纤维酯膜的孔径为0.4μm，预冻温度为-80℃，冷冻干燥时间为24h。

18、需要说明的是，通过本发明所制备的包封vzv-ge蛋白抗原的脂质体混悬液具有较合适的粒径和高的包封率，且带正电荷，可促进抗原的呈递和摄取；

19、冷冻干燥法可通过冰从冻结状态升华，然后在真空下解吸的方式制备得到固体脂质体(slps)，蔗糖分子中的羟基结构可与磷脂极性基团形成氢键，抑制因脱水引起的相邻磷脂间距离的缩小，以改善脂质体的稳定性和长期储存能力。

20、本发明的第三技术目的是提供一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂在提高免疫效应的应用。

21、优选的，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂能同时显著增强体液和细胞免疫效应，有助于预防带状疱疹的发生。

22、进一步地，所述疫苗制剂的免疫途径为皮下注射或肌肉注射，优选肌肉注射。

23、具体地，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂能引起较强的igg、igg1和igg2a抗体水平和显著增加ifn-γ、il-4、il-10细胞因子分泌水平。

24、此外，本发明还进行了上述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的质量和稳定性初步研究，其为重组带状疱疹蛋白疫苗的质量评价和稳定性提供依据。

25、具体地，所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂复溶后的外观为无色泛乳光液体，未检查出可见异物，ph值为7.0～8.0，渗透压摩尔浓度为200～300mosmol/kg，无菌检查和异常毒性检查均符合疫苗的标准要求；所述重组带状疱疹蛋白疫苗制剂在4℃避光条件具有良好的稳定性。

26、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种重组带状疱疹蛋白疫苗制剂及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

27、(1)重组蛋白疫苗成分单纯，具有较好的安全性，但可溶性蛋白抗原易失活或降解，免疫原性低。脂质体作为递送载体能够有效提高抗原抗酶分解和生物降解的稳定性，提高被包封抗原的体循环时间，同时兼具佐剂的功能。其中，阳离子脂质体能够与apcs表面的负电荷之间产生静电相互作用，促进抗原的呈递和摄取。基于此，本发明采用薄膜分散法和冷冻干燥法联用制备共包载vzv-ge抗原和mpla、α-gc、poly(i:c)佐剂的阳离子脂质体复合物，其中，vzv-ge主要通过静电相互作用吸附于复合物表面，mpla和α-gc吸附于复合物磷脂层，poly(i:c)包载于复合物内核。脂质体和佐剂的协同作用显著增强了vzv-ge诱导的体液和细胞免疫效应，有助于预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的发生，为安全有效的带状疱疹疫苗的研发和产业化生产奠定基础。

28、(2)脂质体混悬液在配制或储存过程中会发生自聚集、絮凝和沉淀等不稳定现象，为了改善脂质体的稳定性，后处理技术被应用于去除脂质体混悬液的水分，限制了脂质体的布朗运动，减少颗粒聚集。冷冻干燥法通过冰从冻结状态升华，然后在真空下解吸可制备更稳定的固体脂质体(slps)，同时加入冻干保护剂能抵抗冻结和干燥应力，稳定脂质体结构，防止药物泄露。本发明优选的冻干保护剂为蔗糖，其羟基结构可与磷脂极性基团形成氢键，抑制因脱水引起的相邻脂质体间距离的缩小，改善重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的包封效率和稳定性，有利于其储存。

29、(3)本发明所制备的重组带状疱疹蛋白疫苗制剂的外观、复溶能力和复溶后外观均较佳，具有较理想的粒径和pdi；共包载vzv-ge抗原和mpla、α-gc、poly(i:c)佐剂的阳离子脂质体复合物经冷冻干燥后具有较高的包封率和载药量；具有良好的稳定性，初步质量研究符合疫苗质量标准要求。

30、(4)基于vzv-ge蛋白抗原构建的疫苗通常只具有较强的体液免疫反应，无法诱导较强的细胞免疫，而细胞介导免疫(cmi)在预防潜伏的vzv再活化和防止再活化病毒传播等方面比体液免疫更重要。本发明的重组带状疱疹蛋白疫苗制剂通过肌肉注射免疫，能引起较强的igg、igg1和igg2a等抗体水平；二次免疫后诱导的免疫应答更偏向于th1型介导的细胞免疫，能显著增加ifn-γ、il-4、il-10等细胞因子的分泌水平。

31、(5)本发明应用阳离子脂质体共包载vzv-ge和佐剂，避免vzv-ge和佐剂降解失活，延长vzv-ge在体内的滞留时间，降低佐剂用量，减少毒副反应。且抗原、载体、佐剂可同时冷冻干燥，降低疫苗生产和包装成本，提高产量。进一步地，本发明所采用的制备方法简单高效，质量易于控制，安全性高，易于产业化规模的实施。