一种内质网靶向脂质体、及其制备方法和应用

本发明属于药物制剂，具体涉及一种提高光动力疗法疗效的内质网靶向脂质体、及其制备方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、光动力疗法（pdt）因其非侵入性、全身毒性低、适应性好和可重复操作等优点，已被临床用于皮肤肿瘤、口腔癌和食管癌等肿瘤的治疗。pdt的基本原理是光敏剂、氧和光源之间的光化学反应。然而目前光动力疗法存在局限性以致疗效较低，主要体现为以下三点：（1）氧气：光动力疗法依赖光敏剂消耗氧气生成单线态氧（ros）杀伤肿瘤，然而肿瘤本身为缺氧微环境，氧气浓度低，且光敏剂对氧气的消耗进一步加剧肿瘤的缺氧，使光动力疗法疗效降低；（2）光源：目前大多数光敏剂多为可见光或紫外光激活，光源穿透有限，尽管部分小分子光敏剂可以直接被近红外光（700-1100 nm）激活，但是与其他被可见光或紫外光激活的光敏剂相比，ros生成效率较低；（3）光敏剂：光敏剂产生的ros半衰期非常短（10-320 ns）且在细胞内扩散有限（10-55 nm），引起的内质网应激较弱，杀伤有限。因此需要寻找有效策略解决以上问题以提高光动力疗法疗效。

3、目前已有多项研究针对上述三项进行了改善。通过对光敏剂进行化学修饰提高水溶性或实现内质网靶向，但激发光敏剂的光源穿透有限，因此有研究考虑联用上转换纳米粒（ucnp）。利用ucnp的光源转化，将近红外区光转化为可见光或紫外光激发光敏剂，然而受肿瘤缺氧微环境影响，光动力疗法疗效仍然受限，因此考虑联用产氧剂为光敏剂提供氧气，通过化学修饰联用pt(iv)（产氧剂，需紫外光激发）、光敏剂ce6和ucnp进一步提高光动力疗法疗效。然而ucnp表面可修饰基团有限，若要实现较好的光动力疗法疗效，需要大量修饰光敏剂的ucnp，可能引起潜在的细胞毒性。

4、因此需要开发一种剂型，在保证生物相容性的同时，解决上述三项局限性提高光动力疗法疗效。

技术实现思路

1、为了克服光动力疗法的局限性，本发明设计并制备了一种可以包裹pt(iv)、光敏剂和ucnp的内质网靶向药物递送系统。本发明制备了可靶向内质网的脂质体（pbup-lip），首先，使用更具穿透性的近红外ii区光激发ucnp，联合其光转化，实现更加高效的药物激发；pt(iv)作为产氧剂为光敏剂提供氧气，提高光动力疗法疗效，降低肿瘤缺氧环境对光动力疗法的限制；其次，脂质体的高负载率和高生物相容性可降低生物毒性，另外其表面可进行内质网靶向修饰，通过内质网靶向实现ros更多的内质网蓄积，引起更强的内质网应激，共同提高光动力疗法的疗效和抗肿瘤效果。该发明与现有用于光动力疗法的纳米制剂比较，通过脂质体进行内质网修饰和包裹ucnp，一方面，脂质体的内质网靶向，使纳米制剂聚集于内质网中，在近红外ii区光激发和ucnp的光源转化作用下，pt(iv)为光敏剂提供氧气，产生ros可直接作用于内质网，引起高效的内质网应激，提升光动力疗法疗效，达到了意想不到的效果，具有明显的创造性。

2、本发明第一方面，提供一种脂质体，包括空白脂质体和活性物质，所述空白脂质体中包含二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-pardaxin肽（dspe-peg2000-par），所述活性物质为四价铂（pt(iv)）、光敏剂和上转换纳米粒（ucnp）。

3、进一步的，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-pardaxin肽合成步骤为10 mg pardaxin肽（par，南京莱昂生物科技有限公司购买）溶解在3 ml 无水二甲基甲酰胺中，加入3.41 mg二碳酸二叔丁酯，氮气条件下避光冰浴250 rpm搅拌12小时，随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺 2.88 mg和n-羟基琥珀酰亚胺3.46 mg室温250 rpm搅拌2小时，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基（dspe-peg2000-nh2） 8.39 mg，室温250 rpm搅拌24小时。加入1ml 1m盐酸250 rpm搅拌2小时，使用1m naoh调节ph至7.4，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥后得终产物。

4、如图5所示，通过对特征基团的归属，即：化学位移δ 6.81–8.23 ppm（红色方框）处的信号归因于酰胺键的特征峰；化学位移δ 4.46–4.65 ppm（紫色圆圈）归因于par肽中酰胺键附近的次甲基信号峰，验证了dspe-peg2000-par的成功合成。相关物质结构式为：

5、dspe-peg2000-nh2：

6、

7、pardaxin肽：

8、

9、dspe-peg2000-par：

10、。

11、进一步的，所述空白脂质体为磷脂，胆固醇和dspe-peg2000-par。更进一步的，磷脂、胆固醇、dspe-peg2000-par的比例为50:6.25:1。

12、进一步的，所述光敏剂包括i型光敏剂和ii型光敏剂中的一种或多种。更进一步的，所述的i型光敏剂包括基于纳米材料的i型光敏剂和小分子i型光敏剂中的一种或多种。更进一步的，所述的小分子光敏剂包括基于有机分子的i型光敏剂和基于过渡金属配合物的i型光敏剂中的一种或多种。更进一步的，所述的基于有机分子的i型光敏剂包括硼二吡咯亚甲基染料（bodipy）、瑞达泊芬（redaporfin）、亚甲基蓝中的一种或多种。

13、具体的，本发明实施例中所指出的一种脂质体，包括空白脂质体和活性物质，所述空白脂质体为蛋黄卵磷脂、胆固醇和dspe-peg2000-par，所述活性物质为四价铂（pt(iv)）、硼二吡咯亚甲基染料（bodipy）和上转换纳米粒（ucnp）。

14、本发明另一方面，提供一种脂质体的制备方法，步骤如下：

15、1）溶解bodipy的氯仿溶液和ucnp溶液在冰浴避光条件下混合搅拌；

16、2）步骤1）中加入乙醇溶解的蛋黄卵磷脂、胆固醇和dspe-peg2000-par溶液，在37℃条件下，使用旋转蒸发器除去有机溶剂，成膜；

17、3）步骤2）中加入pt(iv)的葡萄糖溶液，搅拌，超声后，通过离心去除未被包封的药物，得含pt(iv)、bodipy和ucnp的内质网靶向脂质体。

18、进一步的，详细步骤如下：

19、将0.1 mg bodipy氯仿溶液和0.5 mg ucnp溶液在冰浴避光条件下混合搅拌过夜后，加入乙醇溶解的15 mg蛋黄卵磷脂、1.9mg胆固醇和0.3 mg dspe-peg2000-par溶液，在37℃条件下，使用旋转蒸发器除去有机溶剂，成膜，加入1 mg/ml pt(iv)的5%葡萄糖溶液2ml，55 ℃ 950 rpm条件下搅拌30 min，超声1 min后通过3000 rpm离心5 min去除未被包封的药物，得含pt(iv)、bodipy和ucnp的内质网靶向脂质体。

20、用dls测定pbup-lip的粒径和电位，透射电镜表征pbup-lip的表面形态。

21、本发明另一方面，提供一种脂质体在制备光动力疗法药物中的应用。

22、本发明另一方面，提供一种脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

24、（1）本发明将pt（iv）、光敏剂和上转换纳米粒药物组合装载进脂质体中并修饰内质网靶向肽，首先通过内质网靶向实现纳米制剂的内质网蓄积；其次利用上转换纳米粒可以实现单激发双发射，pt(iv)为光敏剂提供氧气生成足够多的ros直接作用于内质网，引起更强的内质网应激，因此可以提高抗肿瘤效果。

25、（2）本发明在合适浓度可显著提高细胞毒性作用。

26、（3）本发明中添加的药物比例以及磷脂胆固醇的浓度都是优化后的数据，其疗效效果较好。本发明所使用原料简单、安全可靠。载体材料磷脂和胆固醇均为人体内源性物质，安全无毒且生物可降解，具有良好的生物相容性。

27、（4）本发明的制备得到的脂质体粒径适宜（100-200nm），更易被肿瘤细胞内吞，提高抗肿瘤效果。