一种用于肿瘤微环境正常化的免疫激活剂的制备及其应用

本发明属于医药，具体涉及一种用于肿瘤微环境正常化的免疫激活剂的制备及其应用。

背景技术：

1、近年来，免疫疗法的出现给癌症治疗的困境带来了曙光。其中，以pd-1抗体和pd-l1抗体为代表的免疫检查点抑制疗法在临床的应用中取得了令人鼓舞的结果。然而，虽然有一些肿瘤患者在经过免疫治疗后病情得到了有效的控制，但是pd-1及pd-l1抗体的总体临床应答率是很低的。通过对疾病的深入研究发现，免疫抑制性的肿瘤微环境(tme)是导致免疫疗法疗效无法发挥的一大障碍。

2、tme是由浸润的免疫细胞、异常的血管系统、间质细胞以及细胞外基质共同组成。其特征是缺氧、代谢异常、肿瘤血管不规则生长等。微环境中的各成分独立工作，并与免疫检查点协同工作，使免疫细胞在tme中的富集和浸润受到抑制，从而使免疫检查点抑制疗法无法发挥作用。因此，如何解除免疫抑制的肿瘤微环境，成为了很多研究的聚焦所在。

3、目前，临床上已有一些针对tme异常成分的药物。比如，血管内皮生长因子(vegf)阻断剂可以提高免疫治疗的疗效，主要来源于其抗血管生成作用可以暂时使肿瘤血管正常化，从而增加抗肿瘤免疫细胞的肿瘤浸润，缓解免疫抑制环境，增强癌症免疫治疗的效果。同时，目前也有临床研究证明，产乳酸的乳酸脱氢酶(ldh)与肿瘤大小和临床严重程度呈正相关，故亦有研究人员开发出多种的针对乳酸代谢为靶点的联合治疗策略。然而，肿瘤微环境是一个具有多种异常成分的整体，单纯改变某一单一的物质并不足以逆转免疫抑制性的肿瘤微环境。因此，目前临床上已有的疗法虽有一定的治疗效果，但也不可避免地存在安全性和脱靶效应的问题。在这样的困境下，开发一种低毒且多效的免疫激活剂或许是一种良好的解决策略。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种免疫激活剂的制备方法，制得的免疫激活剂l-arg@hmno2-lod-ha表现出良好的生物安全性，且具有消耗乳酸、正常化肿瘤血管，调动肿瘤部位的免疫细胞浸润等功能，可以增强anti-pd-l1的疗效。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供了一种免疫激活剂的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、通过刻蚀法制备中空二氧化锰：将曲拉通x-100溶于有机溶剂中，再加入氨水和水，搅拌后再加入teos和aptes,室温下反应18-36h制得二氧化硅，二氧化硅经洗涤后分散在水中，然后再加入高锰酸钾水溶液进行反应，收集得到的纳米颗粒后，经碳酸盐溶液刻蚀后即得；

5、s2、负载精氨酸：将中空二氧化锰和精氨酸溶于水中，室温下搅拌20-30h，使精氨酸分子充分装入中空二氧化锰的空腔内，即得l-arg@hmno2；

6、s3、负载乳酸氧化酶：往l-arg@hmno2溶液中加入pah溶液，破碎、混匀后得到带正电的l-arg@hmno2-pah纳米颗粒，收集纳米颗粒并洗涤后，再加入乳酸氧化酶制成稳定的纳米粒，得到l-arg@hmno2-lod；

7、s4、包裹透明质酸：将透明质酸溶液加入步骤s3的l-arg@hmno2-lod中，搅拌稳定纳米粒后经离心得到免疫激活剂(la@m-lod-ha或l-arg@hmno2-lod-ha)。

8、优选地，步骤s1中，所述有机溶剂为环己烷和正己醇的混合溶液，环己烷与正己醇的体积比为4-5:1。

9、优选地，步骤s1中，所述曲拉通x-100、氨水和水的体积比为100-110：14-17：8-12；所述曲拉通x-100、teos和aptes的体积比为100-110：10：1-3。

10、优选地，步骤s2中，所述中空二氧化锰与精氨酸的质量比为1:8-12。

11、优选地，步骤s3中，l-arg@hmno2溶液中的hmno2浓度为1-3mg/ml，pah溶液的浓度为4-6mg/ml，l-arg@hmno2溶液与pah溶液的体积比为1:1-3。

12、优选地，步骤s3中，l-arg@hmno2溶液与乳酸氧化酶的用量比为1-3mg/ml：400-600ug。

13、本发明第二方面提供了由第一方面所述的制备方法制备得到的免疫激活剂。

14、采用本发明方法制备得到的免疫激活剂(la@m-lod-ha或l-arg@hmno2-lod-ha)，含有中空二氧化锰hmno2(载体，能通过epr效应富集到肿瘤部位)、精氨酸l-arg(能消耗肿瘤微环境中的过氧化氢，并可在过氧化氢存在的肿瘤微环境中产生低剂量一氧化氮，低剂量一氧化氮具有血管正常化作用)、乳酸氧化酶lod(能消耗肿瘤微环境中过量的乳酸，改变因乳酸超载而带来的免疫抑制)以及透明质素ha(包裹在免疫激活剂最外层，到达肿瘤部位后被降解，能保护功能组分在未到达肿瘤部位时不被降解)，进而达到多效改善肿瘤免疫抑制微环境，且具有血管正常化功能的目的。

15、本发明第三方面提供了第二方面所述的免疫激活剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

16、体内和体外实验结果均表明，l-arg@hmno2-lod-ha表现出良好的生物安全性，且具有消耗乳酸、正常化肿瘤血管，调动肿瘤部位的免疫细胞浸润等功能，从而增强anti-pd-l1的疗效的作用。

17、本发明第四方面提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物以第二方面所述的免疫激活剂作为主要活性成分。

18、本发明第五方面提供了一种抗肿瘤组合物，所述抗肿瘤组合物包括第二方面所述的免疫激活剂和pd-l1抗体。

19、优选地，所述抗肿瘤药物或抗肿瘤组合物还包括药学上可接受的辅料。所述载体为药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(plga)、透明质酸等。

20、优选地，所述抗肿瘤药物或抗肿瘤组合物的剂型为药学领域可接受的任一剂型，包括但不限于粉剂、颗粒剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、本发明先制备中空二氧化锰(hmno2)，再负载精氨酸(l-arg)和乳酸氧化酶(lod)，并在外层用透明质酸(ha)包裹，获得一种高效协同且低毒的纳米免疫激活剂(l-arg@hmno2-lod-ha)。本发明的免疫激活剂表现出良好的生物安全性，且具有消耗乳酸、正常化肿瘤血管，调动肿瘤部位的免疫细胞浸润等功能，进而增强anti-pd-l1的疗效的作用。其中，精氨酸是一种存在于人体内的氨基酸，乳酸氧化酶是一种可消耗乳酸的蛋白质，通过h+/h2o2响应的中空二氧化锰递送到酸性含过氧化氢的tme中后，二氧化锰会被响应性降解，精氨酸可与h2o2反应生成低剂量的一氧化氮正常化肿瘤血管，乳酸氧化酶则可消耗tme中超载的乳酸产过氧化氢，而载体二氧化锰又可被过氧化氢催化产生氧气进而缓解乏氧的tme。从而通过增氧、血管正常化和干扰代谢的多重策略，达到有效逆转免疫抑制性的肿瘤微环境的目的。因此，本发明提供的l-arg@hmno2-lod-ha表现出良好的生物安全性，且具有消耗乳酸、正常化肿瘤血管，调动肿瘤部位的免疫细胞浸润等功能，可以增强anti-pd-l1的疗效。