一种斑马鱼自动摆鱼孔板及其应用的制作方法

本发明涉及斑马鱼摆鱼，尤其涉及一种斑马鱼自动摆鱼孔板及其应用。

背景技术：

1、斑马鱼摆鱼拍照分析，是斑马鱼实验很重要的一部分，大部分斑马鱼表型实验，在实验终点时均需要通过拍摄斑马鱼图片进行表型数据采集。在药物、健康食品、化妆品等斑马鱼的实验中，斑马鱼的表型数据采集，常常需要将斑马鱼在侧摆(侧位平躺)的条件下，使用拍照设备和软件拍摄上百个图片，并借助于手动操作进行相关数字图像处理。

2、目前，斑马鱼摆鱼需要人工将鱼放在载玻片上，通过甲基纤维素进行固定，用拨针一尾一尾拨动姿势完成，速度很慢，每次摆鱼拍照均需大量时间，不利于实现实验的高通量数据采集。

3、专利cn113425447a中公开了一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法，该固定装置结构如下：包括孔板本体，孔板本体上设有凹槽，凹槽内均固设有用于固定斑马鱼的固定槽，凹槽的上表面高于固定槽的上表面(即固定槽设置在凹槽内部，而非由凹槽槽底部分区域下凹构成)，当固定槽中的黏着剂溢出时，能将其收纳在凹槽中，防止黏着剂撒在孔板本体的表面；固定方法如下：在固定槽中加入鱼麻醉剂和黏着剂，用吸管吸取出生3-5天的斑马鱼幼鱼，蛋白酶去卵膜，预麻醉后放入固定槽中，用尖头镊将斑马鱼幼鱼拨至两眼重合的侧卧位。采用该专利中的固定装置和方法，虽然能够利用黏着剂将斑马鱼固定在孔板内，便于快速整体移动样品进行观测，仍然需要手动将斑马鱼拨成侧位平躺的姿势，无法实现自动摆鱼。

技术实现思路

1、为了解决现有的斑马鱼摆鱼方法依赖于人工实现，费时费力的技术问题，本发明提供了一种斑马鱼自动摆鱼孔板及其应用。采用该斑马鱼自动摆鱼孔板，能够实现斑马鱼的自动侧位平躺，减小了对人工的依赖，能够减少人力和时间。

2、本发明的具体技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种斑马鱼自动摆鱼孔板，包括板体；所述板体上设有至少一个第一凹槽；所述第一凹槽的槽底设有第二凹槽；所述第二凹槽的槽口设于第一凹槽的槽底；所述第二凹槽的槽口尺寸小于第一凹槽的槽底尺寸。

4、本文中，“侧位平躺”和“侧摆”均是指双眼对齐侧卧并且同一孔板内每条鱼的位置差异不大。

5、本发明的斑马鱼自动摆鱼孔板在使用时，将麻醉后的斑马鱼连同液体一起转移到第一凹槽内(该过程可用移液枪完成)后，通过离心可使斑马鱼进入第二凹槽内，并在第二凹槽的限制配合离心作用下，侧位平躺在第二凹槽内。

6、因此，采用本发明的斑马鱼自动摆鱼孔板，能够实现斑马鱼的自动侧摆，大大减少了人力和时间。并且，每个斑马鱼自动摆鱼孔板中可以设置多个第一凹槽，实现一次性批量摆鱼，因而能够适应高通量实验的需求。

7、此外，若板体上只设有第二凹槽，不设有第一凹槽，则斑马鱼在离心时易脱离第二凹槽，通过加大第二凹槽的深度，虽然能避免斑马鱼脱离，但会造成斑马鱼在通过离心进行自动摆鱼的过程中，易发生一定程度的上浮，造成侧摆成功率较低。而通过将第二凹槽设置在第一凹槽的槽底(即第一凹槽槽底部分区域下凹形成第二凹槽)，在不加深第二凹槽的情况下，离心时斑马鱼即使脱离第二凹槽，也能够被限制在第一凹槽内，在离心作用下易于回到第二凹槽中，进而实现斑马鱼的成功侧摆。

8、作为优选，所述第二凹槽的侧壁为光滑连续的面；所述第二凹槽的尺寸从槽口到槽底逐渐收缩。

9、在进行斑马鱼摆鱼后，往往需要进行拍照来采集和保存数据。本发明团队关注到，当第二凹槽内壁并非光滑连续的面(例如第二凹槽截面为倒三角形或长方形)，以及当第二凹槽的尺寸上小下大时，会导致光线不均，拍照效果不佳，即使斑马鱼自动摆鱼孔板整体采用透明材质，也仍然会存在该问题。基于此，本发明将第二凹槽的内壁设计成光滑连续的面，并将其尺寸设计成从槽口到槽底逐渐收缩，能够较好地确保拍照效果。

10、进一步地，所述第二凹槽的内壁由四个弧口均朝向第二凹槽内部的弧面构成。

11、作为优选，所述第一凹槽的槽底上非第二凹槽的位置设有至少一个通孔。

12、当第一凹槽槽底不设置有通孔时，需要对加液量进行严格控制，才能使斑马鱼自动摆鱼具有较高的成功率，操作相对不便。

13、通过上述通孔的设计，能够使离心后，第二凹槽内仍保留有液体，第一凹槽内其余位置的液体均随着离心从通孔排出，通过这种方式，无需控制加液量，即可避免斑马鱼上浮而造成侧摆成功率下降，同时还能避免斑马鱼离开液体环境过久而死亡。

14、作为优选，所述通孔的孔径为0.05-0.25mm。

15、通孔采用上述尺寸设计，能够提高摆鱼成功率，具体而言：使离心前，第一凹槽内的水不易从通孔渗出，从而使离心时斑马鱼能够在液体和离心作用下进入到第二凹槽内，同时，还能使在离心作用下多余的水可从通孔排出，以避免斑马鱼上浮而影响摆鱼成功率。

16、进一步地，所述通孔的孔径从第一凹槽槽底的上表面至下表面逐渐减小，第一凹槽槽底的上表面和下表面上所述通孔的孔径分别为0.10-0.20mm和0.05-0.08mm。

17、通孔采用孔径上大下小的设计，有助于离心时多余的水通过毛细作用排出。

18、作为优选，所述第二凹槽的最大深度为0.5-2.5mm；所述第一凹槽和第二凹槽的最大总深度为4-11.8mm。

19、进一步地，所述第二凹槽的最大深度为1mm；所述第一凹槽和第二凹槽的最大总深度为6mm。

20、当第二凹槽的最大深度过深时，斑马鱼在摆鱼过程中易上浮，会造成摆鱼效果不佳。当第一凹槽和第二凹槽的总深度(即从第一凹槽槽口到第二凹槽槽底的深度)过浅时，会造成斑马鱼在离心时易离开第一凹槽。基于此，本发明将第二凹槽的最大深度(即深度最大处的深度)以及第一凹槽和第二凹槽的最大总深度(即总深度最大处的深度)分别控制在0.5-2.5mm和4-11.8mm范围内，能够提高自动摆鱼的成功率；当分别设置为1mm和6mm时，能够进一步提高摆鱼成功率。

21、作为优选，所述第二凹槽的槽口宽度为2-3mm，长度为待摆鱼的斑马鱼体长的1.3-2倍，槽底宽度为0-1mm，长度为槽口长度的50-100％。

22、进一步地，所述第二凹槽的槽口宽度为2.5mm，长度为6mm，槽底宽度为0mm，长度为4mm。

23、作为优选，所述第一凹槽的槽底宽度为6-9mm，长度为待摆鱼的斑马鱼体长的1.3-2倍，槽口宽度为7-10mm，长度为槽底长度的1.1-2倍。

24、进一步地，所述第一凹槽的槽口宽度为8mm，长度为8mm，槽底宽度为6mm，长度为6mm。

25、作为优选，所述斑马鱼自动摆鱼孔板的材质为亲水材料(水润湿角不大于90°)。

26、由于斑马鱼的生存需求，随着斑马鱼一同加入第一凹槽内的液体通常为亲水液体(如水)。当斑马鱼自动摆鱼孔板的疏水性过强时，液体加入第一凹槽内后易成滴状，会造成自动摆鱼的成功率下降。

27、此外，相较于施加亲水涂层以赋予孔板表面亲水性而言，采用亲水材质，有利于提高拍照的清晰度。

28、第二方面，本发明提供了所述斑马鱼自动摆鱼孔板在斑马鱼自动摆鱼中的应用。

29、作为优选，所述应用包括以下步骤：将斑马鱼麻醉后，连同液体一起转移到所述斑马鱼自动摆鱼孔板内，每个第一凹槽内放置一尾斑马鱼，而后将斑马鱼自动摆鱼孔板进行离心，实现斑马鱼在第二凹槽内的自动侧位平躺。

30、作为优选，所述离心的转速为500-2000r/min，时间为4-15s。

31、进一步地，所述离心的转速为800r/min，时间为10s。

32、当离心速度过低或时间过短时，斑马鱼侧躺沉底成功率较低；当离心速度过高时，会影响斑马鱼的生理状态。当将离心转速控制在500-2000r/min，时间控制在4-15s时，能够有效提高摆鱼成功率，且对斑马鱼生理状态影响较小；当将离心转速设置为800r/min，时间设置为10s时，能够进一步提高效果。

33、作为优选，所述第一凹槽的槽底为连续完整的平面；在将麻醉后的斑马鱼连同液体一起转移到所述斑马鱼自动摆鱼孔板内时，每个第一凹槽内的加液量为10-25μl。

34、进一步地，所述第一凹槽的槽底为连续完整的平面；在将麻醉后的斑马鱼连同液体一起转移到所述斑马鱼自动摆鱼孔板内时，每个第一凹槽内的加液量为20μl。

35、对于第一凹槽槽底为连续完整的平面(即不设有通孔)的情况而言，当加液量过大时，易出现斑马鱼在摆鱼时上浮，不利于通过离心使其自动侧位平躺沉到第二凹槽；当加液量过小时，不易通过移液枪将斑马鱼连同液体一起转移到孔板内。基于此，本技术将加液量控制在10-25μl范围内(更优选为20μl)，易于通过移液枪吸取斑马鱼和液体，并能够进一步提高自动摆鱼的成功率。

36、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

37、(1)本发明在斑马鱼自动摆鱼孔板中，通过第一凹槽和第二凹槽的配合结构，能够实现斑马鱼的自动侧位平躺，节省了人力和时间，并能满足高通量实验的需求；

38、(2)本发明在斑马鱼自动摆鱼孔板及其使用过程中，通过1○采用具有特定亲疏水性的材质+2○控制第一凹槽的深度以及第一凹槽和第二凹槽的总深度+3○在第一凹槽槽底特定位置设置通孔+4○当第一凹槽槽底无通孔时控制加液量+5○控制转速和时间这几方面的设计，能够提高斑马鱼摆鱼的成功率(当不采用上述几方面设计时，能够实现自动侧摆，但成功率相对较低)。