一种啮齿类动物胰岛提取用穿刺针及胰岛提纯方法

本发明涉及实验动物组织提取技术，具体涉及一种小鼠胰岛的提取与纯化方法。

背景技术：

1、美国学者bensley作为胰岛分离的先驱，在1911年通过对胰岛染色进而手工摘取胰岛，1964年瑞典医生使用显微镜对肥胖糖尿病小鼠的胰腺进行显微解剖来获取胰岛，但和bensley一样，获取的胰岛产量和质量都很差。

2、1965年波兰医生moskalewski首次用胶原酶消化剪碎的胰腺来提取胰岛，但大部分胰岛被胶原酶所破坏，随后美国医生lacy和kostianovsky针对胰腺的解剖结构，应用胆总管穿刺灌注生理盐水使胰腺膨胀的方法，增大胰腺表面与胶原酶的接触面积，促进胰岛的分离。

3、直到1985年日本学者gotoh提出胆总管穿刺灌注胶原酶的方法，成为分离啮齿类动物(如小鼠)胰岛的重要里程碑。

4、此外，分离的胰岛通过传统的手工挑选方法效率低耗时长，难以满足大规模的胰岛分离纯化，密度梯度离心纯化的方法应用而生。从刚开始的糖或白蛋白密度梯度离心液，后续经过不断的改进，出现了高分子量聚合物ficoll离心液，显著提升了胰岛纯化的效果。

5、通过胆总管穿刺灌注胶原酶液和ficoll液密度梯度离心法虽然是当前主要的小鼠胰岛分离纯化方法，但仍有两个关键之处需要进一步改进。一是小鼠的胆总管直径非常细，现有工具及方法在进行胆总管穿刺操作时极易穿透胆总管，尤其是新手很难完成此项关键操作，二是ficoll离心液配制复杂，还具有一定的毒性，且密度梯度离心后手工挑选胰岛耗时较长，进一步增加了胰岛在ficoll离心液中的存在时间而加重损伤，挑选至培养基后还会残留ficoll离心液，仍需多次更换培养基，以减少ficoll离心液残留。

6、获取的胰岛数量除了与分离纯化方法相关外，还与小鼠的品系、体重、周龄有关，此外胶原酶的种类、浓度、消化时间也对胰岛获取有着重要的影响。胶原酶ⅴ和胶原酶p是分离小鼠胰岛常用的两种胶原酶，美国学者villarreal应用添加bsa(为胰岛提供营养)的胶原酶p(1mg/ml)，37℃消化12-13min，每只小鼠可获得250-350个胰岛。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷或不足，本发明一方面提供了一种啮齿类动物胰岛提取用穿刺针。

2、为此，本发明所提供的穿刺针包括金属管，该金属管一端套有非金属毛细管，所述非金属毛细管的外径小于啮齿类动物胆总管的内径，且非金属毛细管可穿过胆总管。同时非金属毛刺管的材质可避免在穿过胆总管时不会刺破组织。所述金属管的外径允许非金属管套在金属管上。

3、可选的方案是，所述金属管长度为：6-20mm；合理外径范围为：0.18-0.19mm，合理内径范围为：0.06-0.11mm；所述非金属毛细管合理长度范围为：1-3cm，合理外径范围为：0.20-0.30mm，合理内径范围为:0.10-0.19mm。

4、可选的方案是，所述非金属毛细管的材质可为聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、聚氨酯(pu)材质。所述非金属毛细管的硬度范围为洛氏a85-105。

5、可选的方案是，所述金属管的一端伸入非金属毛细管3-5mm。

6、进一步的方案是，本发明的穿刺针还包括注射器，所述金属管的另一端连接在注射器上。

7、本发明同时提供了上述穿刺针的制备方法。所述穿刺针的制备方法包括：

8、(1)将实心金属尖针加热，之后将非金属毛细管一端管口套在加热后的针尖上，使得非金属毛细管管口扩张；然后将非金属毛细管从针尖上取下；

9、(2)将金属显微注射针的针头磨平后得到金属管；

10、(3)将非金属毛细管扩张后的管口套装在金属管末端，得到穿刺针。

11、可选的方案是，步骤1中将非金属毛细管套入加热后的针尖3-5mm。

12、本发明同时提供了一种啮齿类动物胰岛提纯方法，方法包括：胰岛分离和纯化；其中胰岛分离采用上述穿刺针进行，所述胰岛分离方法包括：

13、(1)对啮齿类动物麻醉、消毒后开腹，之后将空肠、回肠和结肠翻转至啮齿类动物左侧，暴露十二指肠、胆总管和胆囊；

14、(2)沿十二指肠找到十二指肠大乳头，用动脉夹沿着十二指肠内侧缘夹闭十二指肠大乳头，或用手术缝线在十二指肠大乳头处进行结扎，随后暴露胸腔，剪破右心房彻底放血；

15、(3)注射器吸取胶原酶液后，将注射器针头更换为消毒后的穿刺针；之后夹住胆囊上端，在胆囊上端处开一与非金属毛细管外径相当的开口，将穿刺针的非金属毛细管远端插入开口，继续经胆囊插入至胆总管，直至非金属毛细管远端距十二指肠乳头5-10mm处，推动注射器灌注胶原酶液，使胰腺充盈膨胀，然后剪断胰腺周围结缔组织，沿十二指肠和盲肠分离取下胰腺；所述胶原酶液为胶原酶p溶液或胶原酶v溶液。

16、可选的方案是，所述纯化包括胰腺消化，之后采用histopique-1077液对胰腺消化组织进行密度梯度离心，然后采用40μm的细胞滤网对离心上清液进行过滤收集胰岛。

17、采用本发明的方法可显著提高小鼠胰岛提取纯化的质量和效率，大幅节省操作时间，提高胆总管穿刺的成功率，纯化后的胰岛产量、纯度、活力和胰岛素分泌功能均良好，是一种操作简单、便捷高效的小鼠胰岛提取纯化方法。具体表现为：

18、本发明的方法设计了一种简易实用的穿刺针，该针结构相对简单，操作方便，连接金属管的透明毛细管，其直径略小于啮齿类动物的胆总管的直径，且具有良好的弹性和形变，在穿刺时经胆囊切口，易于穿入胆总管，并可沿着胆总管持续穿入至距十二指肠乳头处5-10mm，操作过程中毛细管因具有良好的弹性刺破胆总管的概率较低，且远端离十二指肠乳头近，显著减少了胶原酶液的返流。进一步的纯化步骤中，在加入histopique-1077液进行密度梯度离心后，采用40μm的细胞滤网进行过滤收集胰岛，与单纯手工挑选胰岛法相比，即提高了胰岛收集的数量和速度，又可经过培养基冲洗滤网以洗涤胰岛去除有毒性的histopique-1077液，提高胰岛的存活能力。

19、本发明提取和纯化后的胰岛，杂质细胞数量显著降低，胰岛包膜完整，纯度高，活力好，糖促胰岛素分泌功能良好，提示可用此方法提取纯化胰岛并用于体内或体外研究。

技术特征：

1.一种啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，所述穿刺针包括金属管，该金属管一端连接有非金属毛细管，所述非金属毛细管的外径小于啮齿类动物胆总管的内径，且非金属毛细管可穿过胆总管。

2.根据权利要求1所述的啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，所述金属管长度为：6-20mm；外径为：0.18-0.19mm，内径为：0.06-0.11mm；所述非金属毛细管长度为：1-3cm，外径为：0.20-0.30mm，内径为:0.10-0.19mm。

3.根据权利要求1所述的啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，所述非金属毛细管的材质可为聚丙烯、聚乙烯或聚氨酯材质。

4.根据权利要求1所述的啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，所述非金属毛细管的硬度范围为洛氏a85-105。

5.根据权利要求1所述的啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，所述金属管的一端伸入非金属毛细管3-5mm。

6.根据权利要求1所述的啮齿类动物胰岛提取用穿刺针，其特征在于，还包括注射器，所述金属管的另一端连接在注射器上。

7.权利要求1所述穿刺针的制备方法，其特征在于，所述穿刺针的制备方法包括：

8.根据权利要求7所述穿刺针的制备方法，其特征在于，步骤1中将非金属毛细管套入加热后的针尖3-5mm。

9.一种啮齿类动物胰岛提纯方法，方法包括：胰岛分离和纯化；其特征在于，所述胰岛分离采用权利要求1所述穿刺针进行，所述胰岛分离方法包括：

10.根据权利要求9所述的啮齿类动物胰岛提纯方法，其特征在于，所述纯化包括胰腺消化，之后采用histopique-1077液对胰腺消化组织进行密度梯度离心，然后采用40μm的细胞滤网对离心上清液进行过滤收集胰岛。

技术总结
本发明公开了一种啮齿类动物胰岛提取用穿刺针及胰岛提纯方法，所公开的穿刺针包括金属管，该金属管一端连接有非金属毛细管，所述非金属毛细管的外径小于啮齿类动物胆总管的内径，且可穿过胆总管。所公开的方法是采用所述穿刺针经胆囊和胆总管穿刺置管，注射胶原酶P液灌注和消化胰腺，应用密度梯度离心液离心消化后的胰腺，再通过细胞筛网过筛以提取纯化胰岛。本发明可显著缩短胰岛提取实验操作时间，有效解决胆总管穿刺难度大成功率低的瓶颈难题。纯化后的胰岛产量和纯度高，活力和分泌功能良好，胰岛培养过程中贴壁率高，是一种操作简单、便捷高效的小鼠胰岛提取纯化方法。

技术研发人员：张文成,杨硕,高彬,鱼馨文,孙飞
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11