一种传染性法氏囊病病毒变异株的VP2蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程疫苗，具体涉及一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)属于双rna病毒科，禽双rna病毒属。ibdv可分为两个血清型，称为1型和2型，其中血清2型的毒株对鸡没有毒力。血清1型毒株根据致病力又可分为三种类型，分别是经典血清1型、变异型，以及超强毒力vvibdv。

2、基于饲养管理水平的提高和疫苗的广泛使用等因素，vvibdv感染逐渐被控制。2017年至今，不同于早期变异株的ibdv新型变异株vaibdv呈现流行趋势，其引起的非典型传染性法氏囊病(ibd)对禽类养殖带来了新的威胁。

3、在vvibdv的防控过程中，以主要保护性蛋白vp2为抗原的亚单位疫苗取得了很好的防控效果。但以vvibdv为基础而开发的亚单位疫苗已经不能控制新变异株的感染，所以亟需以新出现的vaibdv为防控目标，开发新的亚单位疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，通过大肠杆菌表达vaibdv的vp2蛋白，获得可溶性表达产物，制备亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白，所述传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示，所述传染性法氏囊病病毒变异株为vaibdv。

4、本发明还提供了一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)根据ncbi中发表的ibdv的vp2基因序列，设计并合成引物序列，以传染性法氏囊病病毒变异株vaibdv提取核酸作为模板，根据所设计的引物对编码传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白氨基酸序列的目的基因进行pcr扩增；

6、(2)将步骤(1)所得的pcr扩增产物克隆到peasy-t3载体上，得到peasy-t3-vp2质粒；

7、(3)将peasy-t3-vp2质粒和pet-28a质粒均用bamhi和xhoi分别进行双酶切，得到目的基因片段和质粒；

8、(4)将所得到的目的基因片段和质粒按照t4 dna连接酶反应进行连接，得到连接产物；

9、(5)将连接产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒进行测序分析，测序正确的质粒命名为pet-28a-vp2；

10、(5)将pet-28a-vp2质粒转化至表达系统诱导表达vp2蛋白；

11、(6)将得到的vp2蛋白进行内毒素的去除后与佐剂进行混合，得到传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗。

12、进一步的，在步骤(1)中，所述引物序列包括seq id no.1所示的正向引物vp2-f和seq id no.2所示的反向引物vp2-r。

13、进一步的，在步骤(3)中，所述分别进行双酶切的具体步骤为，分别采用2μg的pet-28a或peasy-t3-vp2、5μl的10×buffer、2μl的限制性内切酶bamhi、2μl的限制性内切酶xhoi，后加入ddh20补充至50μl的酶切体系放置37℃水中水浴1h，pet-28a和peasy-t3-vp2进行双酶切。

14、进一步的，在步骤(4)中，所述连接的具体步骤为：按照2μl的10×buffer、1μl的t4dna连接酶、90fmol的dna目的片段、30fmol的线性化载体pet-28a，后加入ddh20补充至20μl，构建连接体系，将该连接体系在25℃反应30min。

15、进一步的，在步骤(6)中，所述内毒素的去除的具体步骤为：在离心管内中加入vp2蛋白和1.0％的曲拉通x-114，涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复3次脱毒。

16、进一步的，在步骤(6)中，所述与佐剂进行混合的具体步骤为：

17、(1)用pbs将vp2蛋白稀释至100μg/ml，后加入4％的tween-80，得到水相；

18、(2)将marcol 52白油，span-80，硬脂酸铝按照94:6:2的比例混匀，高压灭活后得到油相；

19、(3)按照水相:油相的体积比为1:3进行乳化，即得传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗。

20、本发明还提供了一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗在传染性法氏囊病病毒防治中的应用。

21、进一步的，所述传染性法氏囊病病毒的株型为vaibdv。

22、本发明公开了以下技术效果：

23、本发明采用vp2蛋白制备基因工程亚单位疫苗，安全有效，利用免疫攻毒法评估疫苗保护效果，确认疫苗组可以提供100％保护，可以完全保护鸡群不被新型vaibdv感染，具有很好的商品化开发前景。

技术特征：

1.一种传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白，所述传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示，所述传染性法氏囊病病毒变异株为vaibdv。

2.权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述引物序列包括seq id no.1所示的正向引物vp2-f和seqid no.2所示的反向引物vp2-r。

4.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述分别进行双酶切的具体步骤为，分别采用2μg的pet-28a或peasy-t3-vp2、5μl的10×buffer、2μl的限制性内切酶bamhi、2μl的限制性内切酶xhoi，后加入ddh20补充至50μl的酶切体系放置37℃水中水浴1h，pet-28a和peasy-t3-vp2进行双酶切。

5.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述连接的具体步骤为：按照2μl的10×buffer、1μl的t4dna连接酶、90fmol的dna目的片段、30fmol的线性化载体pet-28a，后加入ddh20补充至20μl，构建连接体系，将该连接体系在25℃反应30min。

6.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述内毒素的去除的具体步骤为：在离心管内中加入vp2蛋白和1.0％的曲拉通x-114，涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复3次脱毒。

7.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述与佐剂进行混合的具体步骤为：

8.如权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒变异株的vp2蛋白亚单位疫苗在传染性法氏囊病病毒防治中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述传染性法氏囊病病毒的株型为vaibdv。

技术总结
本发明公开一种传染性法氏囊病病毒变异株的VP2蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程疫苗技术领域。所述亚单位疫苗包括传染性法氏囊病病毒变异株的VP2蛋白，所述传染性法氏囊病病毒变异株的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述传染性法氏囊病病毒变异株为vaIBDV。该技术将vaIBDV的VP2基因克隆到原核表达载体pET‑28a，转化至大肠杆菌构建工程菌，诱导工程菌表达获得可溶性VP2蛋白。本发明制备蛋白与常规矿物油佐剂配制亚单位疫苗，利用免疫攻毒法评估疫苗保护效果，疫苗组可以提供100％保护，具有很好的商品化开发前景。

技术研发人员：朱杰,牛晓赛,张飞,耿兴良
受保护的技术使用者：山东滨州博莱威生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6