一种止血微球颗粒及其制备方法和应用与流程

本技术涉及医用材料领域，具体涉及一种止血微球颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，而出血失控被认为是导致患者或伤员死亡的首要原因。目前止血方法主要包括按压止血和局部使用止血材料止血两种，但是这两种方法对内出血均很难起效。相比较而言，止血粉因其能够处理大的血流，而且能够完整的覆盖伤口之上，受到人们的关注。止血粉放置于伤口后会吸收血液或者吸附血细胞形成胶状体，浓缩血细胞和止血因子从而达到止血的目的。

2、胶原止血材料有很好的止血性能，而且还有引导组织修复再生的作用，是目前研究发现的最好的可吸收止血材料之一，但现有工艺制作的胶原止血材料主要存在制备过程复杂，材料交联时需要使用大量化学交联剂，会造成交联剂残留，产生细胞毒性，制备过程中会破坏胶原蛋白活性，影响止血效果等缺陷。

3、例如，申请号为201511015505.6的中国专利申请以胶原蛋白为原料，胶原蛋白通过紫外线辐射交联，再经喷雾干燥制备止血颗粒，虽然制得的材料可以快速吸水止血，但喷雾干燥过程的温度过高(110℃)容易导致胶原蛋白变性，降低胶原蛋白的生物活性。

4、因此，本领域亟需研发一种止血性能良好，细胞毒性小，使用安全性高，力学性能优异，且可保持胶原蛋白生物活性的止血材料。

技术实现思路

1、本技术所要解决的技术问题是克服现有技术中止血粉在制备过程中影响胶原蛋白活性，交联剂残留量高，细胞毒性大等缺陷，而提供一种止血微球颗粒及其制备方法和应用。本技术以胶原蛋白为原料，采用双水相乳化法制备止血微球颗粒，制备过程中温度低，并减少有机试剂的加入量，可以保证胶原蛋白的生物活性；采用核辐射和化学相协同的交联方法也可减少终产品中交联剂的残留，进而减小细胞毒性，还具有优异的力学性能。本技术制得的止血微球颗粒可以起到快速止血作用，也可为组织细胞提供良好的再生修复微环境。

2、本技术采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、本技术提供一种止血微球颗粒的制备方法，其包括如下步骤：胶原蛋白溶液、聚合物粘性水溶液混合，制得物料a；向所述物料a中滴加戊二醛水溶液进行化学交联，所述化学交联的过程中还进行核辐射交联，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～25kgy，制得所述止血微球颗粒；

4、其中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为5‰～20‰；所述胶原蛋白中i型胶原蛋白的质量百分比为90％以上；所述聚合物粘性水溶液包括葡聚糖水溶液和/或普鲁兰多糖水溶液；所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％～45％，葡聚糖的数均分子量为8万～120万；所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2％～8％，普鲁兰多糖的数均分子量为10万～60万；所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.05％～0.5％。

5、在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为8‰～15‰。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为5‰、6‰、7‰、8‰、9‰、10‰、11‰、12‰、13‰、14‰、15‰、16‰、17‰、18‰、19‰或20‰。

6、在一些实施方案中，所述胶原蛋白中i型胶原蛋白的质量百分比为95％以上。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白中i型胶原蛋白的质量百分比为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.3％、97％、98％或99％。

7、在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液中溶剂可包括酸性溶液。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液中溶剂包括醋酸水溶液和/或盐酸。

8、其中，所述酸性溶液的ph值可为1.8～5。在一些具体实施方案中，所述酸性溶液的ph值为1.8～2.5。在一些更具体实施方案中，所述酸性溶液的ph值为1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。

9、在一些实施方案中，所述聚合物粘性水溶液的粘度可为3000～8000mpa.s，较佳地为5000～6000mpa.s。所述聚合物粘性水溶液的粘度的测试方法包括如步骤：将所述聚合物粘性水溶液温度调节至25℃，使用b型粘度计以30rpm进行测量。

10、在一些实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为18％～42％。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为20％～40％。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％或45％。

11、在一些实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～110万。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为10万～100万。在一些更具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万、10万、20万、30万、40万、50万、60万、70万、80万、90万、100万、110万或120万。

12、在一些具体实施方案中，当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～20万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为35％～45％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量大于20万，小于等于70万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为20％～35％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量大于70万，小于等于120万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％～25％。

13、在一些更具体实施方案中，当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～15万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为38％～42％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为40万～60万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为25％～35％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为90万～110万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为18％～22％。

14、在一些实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2.5％～5.5％。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为3％～5％。在一些更具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％或8％。

15、在一些实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为15万～55万。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为20万～50万。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为10万、12万、15万、20万、25万、30万、35万、40万、45万、50万、55万或60万。

16、在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比可为1:(2～10)。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:(2～5)。在一些更具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:2、1:2.3、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

17、在一些实施方案中，所述混合可按照本领域常规在涡旋仪上进行。

18、在一些实施方案中，所述混合的时间可为本领域常规，一般可为2～10min。在一些具体实施方案中，所述混合的时间为2～5min。在一些具体实施方案中，所述混合的时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。

19、在一些实施方案中，所述混合的温度可为室温。

20、在一些实施方案中，所述混合的过程中还可进一步添加止血活性成分。

21、其中，所述止血活性成分可包括本领域常规使用的具有止血功能的物质，一般可包括凝血酶、bfgf、止血敏、止血芳酸和维生素k中至少一种。

22、其中，所述止血活性成分的用量可按照本领域常规根据各止血活性成分的常规添加量添加。

23、当所述止血活性成分为bfgf时，所述胶原蛋白溶液与所述bfgf的质量比可为1:(10-6～10-5)。在一些具体实施方案中，当所述止血活性成分为bfgf时，所述胶原蛋白溶液与所述bfgf的质量比1:(5×10-6～8×10-5)。在一些更具体实施方案中，当所述止血活性成分为bfgf时，所述胶原蛋白溶液与所述bfgf的质量比为1:10-6、1:(2×10-6)、1:(3×10-6)、1:(4×10-6)、1:(5×10-6)、1:(6×10-6)、1:(6.7×10-6)、1:(7×10-6)、1:(8×10-6)、1:(9×10-6)或1:10-5。

24、当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比可为1:(10-6～10-5)。在一些具体实施方案中，当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比为1:(5×10-6～8×10-5)。在一些更具体实施方案中，当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比为1:10-6、1:(2×10-6)、1:(3×10-6)、1:(4×10-6)、1:(5×10-6)、1:(6×10-6)、1:(6.7×10-6)、1:(7×10-6)、1:(8×10-6)、1:(9×10-6)或1:10-5。

25、在一些实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.08％～0.3％。在一些具体实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.1％～0.2％。在一些具体实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.05％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％。当所述戊二醛水溶液中所述戊二醛的质量百分比高于0.5％时，会导致终产品中戊二醛的残留量过高，增加细胞毒性，降低使用安全性。

26、在一些实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比可为(10～100)：1。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为(20～40)：1。在一些更具体实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为15：1、20：1、25：1、30：1、45：1、50：1、60：1、70：1、80：1或90：1。

27、在一些实施方案中，所述化学交联和所述核辐射交联同时开始进行。

28、在一些实施方案中，所述化学交联的时间可为5～24h。在一些具体实施方案中，所述化学交联的时间为5～8h。在一些更具体实施方案中，所述化学交联的时间为5h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h。

29、在一些实施方案中，所述化学交联的温度可为15～30℃。

30、在一些实施方案中，所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束、γ射线、中子束、粒子束中至少一种。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束和/或γ射线。在一些更具体实施方案中，所述γ射线包括基于钴60放射源的γ射线。所述核辐射交联是利用各种核辐射引发交联反应的技术手段。

31、在一些实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～15kgy。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～12kgy。在一些更具体实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8kgy、9kgy、10kgy、11kgy、12kgy、13kgy、14kgy、15kgy、16kgy、17kgy、18kgy、19kgy、20kgy、21kgy、22kgy、23kgy、24kgy或25kgy。

32、在一些实施方案中，所述核辐射交联的时间可为20～60min。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的时间为20～40min。在一些更具体实施方案中，所述核辐射交联的时间为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。

33、在一些实施方案中，所述化学交联的操作后还可进一步包括离心并收集固体颗粒、清洗和冻干中至少一种的操作。

34、其中，所述离心的条件和方法可为本领域常规，所述离心的目的为去除体系中未参与交联的聚合物，并收集所述止血微球颗粒。

35、其中，所述清洗的过程中采用的清洗剂可包括磷酸盐缓冲液、生理盐水和纯化水中至少一种。

36、其中，所述清洗的过程中，所述固体颗粒与清洗液的体积比可为1:(2～10)。在一些实施方案的所述清洗的过程中，所述固体颗粒与所述清洗液的体积比为1：(2～5)。在一些实施方案的所述清洗的过程中，所述固体颗粒与所述清洗液的体积比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

37、其中，所述清洗的次数可为2～5次。在一些实施方案中，所述清洗的次数为2～4次。在一些具体实施方案中，所述清洗的次数为3次。

38、在一些实施方案中，所述胶原蛋白可包括猪肠膜胶原蛋白和/或牛跟腱胶原蛋白。

39、在一些实施方案中，所述胶原蛋白的制备方法可包括如下步骤：猪大肠膜和/或牛跟腱经灭活、脱脂、脱细胞、冻干和酶解，制得所述胶原蛋白。

40、其中，所述灭活的条件和方法可为本领域常规，一般采用灭活溶剂浸泡，即可；

41、所述灭活的过程中，所述灭活溶剂可包括乙醇和/或乙醇水溶液。

42、当所述灭活溶剂包括所述乙醇水溶液时，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比可为大于等于45％，小于100％。在一些具体实施方案中，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比为50％～90％。在一些具体实施方案中，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比为45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

43、当所述灭活溶剂包括所述乙醇和所述乙醇水溶液时，所述灭活溶剂至少包括4个浓度，且采用每个浓度的所述灭活溶剂时的浸泡时间可为1～3h。在一些具体实施方案中，当所述灭活溶剂包括所述乙醇和所述乙醇水溶液时，所述灭活溶剂至少包括4个浓度，且采用每个浓度的所述灭活溶剂时的浸泡时间为2h。

44、其中，所述脱脂的条件和方法可为本领域常规，一般采用脱脂液浸泡所述灭活后的物料，即可。

45、所述脱脂的过程中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比可为0.1～0.5g/ml。在一些具体实施方案中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比为0.1～0.3g/ml。在一些具体实施方案中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比为0.2g/ml或0.4g/ml。

46、所述脱脂的过程中，所述脱脂液可包括本领域常规使用的溶剂脱脂液，一般可包括烷烃类溶剂脱脂液和/或酮类溶剂脱脂液。在一些具体实施方案中，所述脱脂液包括正己烷和/或丙酮。

47、所述脱脂的过程中，所述脱脂的次数可为2～4次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的次数为3次。

48、所述脱脂的过程中，所述脱脂的时间可为6～30h/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的时间为20～26h/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的时间为10h/每次、15h/每次、24h/每次或28h/每次。

49、所述脱脂的操作后还可进一步包括清洗的操作。

50、所述脱脂后的所述清洗的次数可为3～7次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的次数为4～6次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的次数为5次。

51、所述脱脂后的所述清洗的时间可为不少于20min/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的时间不少于30min/每次。

52、所述脱脂后的所述清洗使用的清洗剂可包括水。

53、其中，所述脱细胞的条件和方法可为本领域常规，一般采用表面活性剂浸泡所述脱脂后物料，即可。

54、所述脱细胞过程中，所述表面活性剂可包括非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂可包括醚类非离子表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂包括聚乙二醇辛基苯基醚。在一些具体实施方案中，所述阴离子表面活性剂可包括c12～c18脂肪醇硫酸盐类表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。

55、在一较佳实施方案的所述脱细胞过程中，将所述脱脂后的物料依次浸泡在质量百分比为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中、浸泡在质量百分比为0.5％～2％的十二烷基硫酸钠水溶液中和浸泡在水中。

56、在一更佳实施方案的所述脱细胞过程中，具体包括如下步骤：

57、(a)将25～35g所述脱脂后的物料浸泡在140～160ml质量百分比为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中0.5～3h，所述浸泡在摇动的条件下进行；

58、(b)将步骤(a)制得的物料浸泡在150～200ml质量百分比为0.5％～2％的十二烷基硫酸钠水溶液中6～24h，所述浸泡在摇动的条件下进行；

59、(c)将步骤(b)制得的物料浸泡在150～200ml质量百分比为0.8％～1.2％的十二烷基硫酸钠水溶液中5～10h，所述浸泡在摇动的条件下进行；

60、(d)将步骤(c)制得的物料浸泡在水中，所述浸泡的次数至少为5次，所述浸泡的时间不少于30min/每次。

61、上述步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，所述摇动的转速可各自独立的为100～300rpm。

62、其中，所述冻干的条件和方法可为本领域常规，一般可在冻干机中进行。

63、其中，所述冻干的操作后还可进一步包括粉碎的操作。

64、其中，所述酶解的条件和方法可为本领域常规，一般将所述冻干后的物料溶解在盐酸乙醇溶液中，再与胃蛋白酶混合，即可。

65、所述酶解过程中，所述盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为0.005～0.015mol/l，乙醇的质量百分比为4％～10％；在一些具体实施方案中，所述盐酸乙醇溶液中，盐酸的浓度为0.01mol/l，乙醇的质量百分比为5％。

66、所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.005～0.05g/ml。在一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.005～0.02g/ml。在一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.01g/ml、0.03g/ml或0.04g/ml。

67、所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比可为(8～15)：1。一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比为(9～12)：1。一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比为10：1或11：1。

68、所述酶解过程中，所述酶解的时间可为70～80h。一些具体实施方案中，所述酶解的时间为72h、74h、76h或78h。

69、其中，所述酶解的操作后还可进一步包括透析和/或二次冻干的操作。所述透析的目的是去除端肽。

70、在一些实施方案中，所述透析采用的透析袋的截留分子量可为40～60kd。在一些具体实施方案中，所述透析采用的透析袋的截留分子量为45kd、50kd或55kd。

71、在一些实施方案中，所述透析的时间为40～100h。在一些具体实施方案中，所述透析的时间为48～96h。在一些更具体的实施方案中，所述透析的时间为50h、60h、70h、72h、80h或90h。

72、本技术还提供一种止血微球颗粒，其由如上所述的止血微球颗粒的制备方法制得。

73、本技术还提供一种如上所述的止血微球颗粒作为原料在制备止血材料中的应用。

74、其中，所述止血材料的剂型可为本领域常规使用的粉剂。

75、本技术还提供一种如上所述的止血微球颗粒在止血治疗中的应用。

76、本技术还提供一种止血治疗方法，其包括将如上所述的胶原蛋白多孔微球施用于有此需要的个体的出血部位。

77、在本发明中，“个体”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括但不限于脊椎动物例如非人类灵长类、羊、狗和啮齿类，例如小鼠、大鼠和豚鼠。在优选的实施方案中，所述个体是人。当个体是人类时，所述个体在本文中可称为患者。

78、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本技术各较佳实例。

79、本技术所用试剂和原料均市售可得。

80、本技术的积极进步效果在于：本技术以胶原蛋白为原料，采用双水相乳化法制备止血微球颗粒，制备过程中温度低，并减少有机试剂的加入，可以保证胶原蛋白的生物活性；采用物理和化学相协同的交联方法也可减少终产品的细胞毒性，还具有优异的力学性能；本技术制得的止血微球颗粒还可用于包覆止血活性成分，对止血活性成分具有良好的包覆能力和释放能力。本技术制得的止血微球颗粒可以起到快速止血作用，也可为组织细胞提供良好的再生修复微环境。