CD83+、CD83+PD-L1+间充质干细胞及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种免疫抑制或抑炎功能易赋能型cd83+间充质干细胞、以及免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞，以及其体外筛选或基因修饰过表达试剂盒、免疫抑制或抑炎诱导试剂盒、质量评估方法及应用。

背景技术：

1、随着干细胞治疗技术研究的深入，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)已被认为是用于组织损伤性疾病以及免疫或炎症相关性疾病治疗的理想工具。mscs是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛分布于成人骨髓、脂肪、牙髓、胎盘和脐带等组织中。诸多研究证实，mscs不仅具有极强的自我更新能力以及向中胚层、外胚层和内胚层的多向分化潜能，而且兼具良好的免疫/炎症调节能力，通过调节t细胞、nk细胞和巨噬细胞等免疫细胞的增殖、分化、分泌和极化等功能，从而有效调节机体免疫/炎症反应失衡。同时，其还能有效抑制受损组织原位细胞的凋亡，促进血管生成以及激活组织原位干细胞等多种生物学特性，参与受损组织的再生与修复。因此，mscs移植不仅能恢复患者失衡的免疫反应或者炎症反应，同时又有组织再生和修复功能，基于这些特点使mscs移植有望成为损伤、炎症和免疫相关性疾病治疗的一种理想策略。

2、已被证实，mscs除通过分化和分泌细胞生长因子等方式直接参与受损组织的再生修复外，还可通过调节机体炎症/免疫反应失衡，修复机体免疫稳态，避免靶器官继发炎性损伤，改善机体组织修复微环境，促进受损组织再生修复。鉴于mscs移植治疗炎症和免疫相关性疾病，既能从根本上恢复机体炎症/免疫反应失衡，同时又能促进受损组织的再生修复，因此mscs移植被认为是一种治疗损伤、炎症和免疫相关性疾病极具潜力的理想策略。然而，随着mscs移植治疗炎症/免疫相关疾病临床数据量的增加，发现mscs移植治疗炎症/免疫相关疾病的临床疗效存在巨大个体差异，即使是同种疾病部分患者有疗，但部分患者无效甚至出现相反结果。

3、随着对mscs特性及其炎症/免疫调节机制的深入了解，发现mscs天然状态下无组织修复和炎症调节活性，其组织修复和免疫调节功能依赖微环境刺激才得以赋能。在组织修复方面，静息状态下的mscs无组织修复能力，其组织修复能力的获得依赖tgf-β、bmp、hgf和pdgf等生长因子刺激才得以赋能，且不同的刺激因素可诱导mscs不同的分化方向和细胞生长因子分泌谱，进而影响mscs的组织修复功能，并呈现出不同的再生修复结果。同样，mscs炎症/免疫调节功能也并不是组成性的，即天然状态下mscs的炎症/免疫调节能力低下，其炎症/免疫调节功能的获得依赖炎性/免疫微环境刺激才得以赋能，并受众多因素调控，如mscs需经ifn-γ、tnf-α和il-1β等炎性因子刺激后，发生免疫抑制或者抑炎功能重编程，后表达pd-l1、ido和il-10等抑炎介质或者受体，才能发挥免疫抑制或者抑炎效应。此外，尽管目前我们认为mscs具有强大的免疫抑制或者抑炎功能，但mscs对宿主炎症/免疫的调节具有双向性，既可激活免疫或者促炎，也可抑制免疫或者抑炎，而mscs兼具炎症/免疫调节的双向性极大影响其治疗炎症/免疫性疾病的临床疗效。已证实，tgf-β1和tlr4激动剂lps可诱导mscs重编程为免疫激活或者促炎表型，发挥促炎效应。tlr3激动剂或炎性因子(如ifn-γ、il-1β和tnf-α等)则诱导mscs重编程为抑炎或者免疫抑制表型，发挥抑炎效应。然而，众多炎症/免疫相关性疾病患者因病因和病程等差异，部分患者机体微环境中常共存即可诱导mscs促炎赋能又可抑炎赋能的因子或者介质，致促/抑炎mscs共存；或者部分患者缺乏抑炎赋能因子，致mscs抑炎赋能重编程障碍。上述原因可能是mscs移植治疗炎症/免疫相关疾病出现治疗抵抗和临床疗效存在巨大个体差异的重要原因。因此，如何赋能和维系mscs的抑炎或者免疫抑制功能是提高mscs移植治疗炎症/免疫相关性疾病临床疗效的关键技术环节。

4、大量研究证实，mscs是一种异质性多潜能干细胞群，存在多功能亚群和组织来源差异。wang z等利用scrna-seq比较脂肪、骨髓和脐带等来源的mscs差异，发现了7个组织特异和5个功能保守的mscs亚群，相较而言脐带mscs(huc-mscs)具有更强的炎症调节潜能。zhang s等在原代mscs中发现2个炎症调节和组织分化功能差异的功能亚群。然而，尽管已有mscs异质性研究，但仅简单比较了其组织来源差异，缺乏功能分群的特征信息。另外，从静态mscs获得的异质性数据难以代表炎性疾病进程中mscs炎性调节亚群的时空赋能编程信息。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种免疫抑制或抑炎功能易赋能型cd83+间充质干细胞，及免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞及其制备方法；同时本发明还提供了该免疫抑制或抑炎功能易赋能型cd83+间充质干细胞，及免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞的应用。具体为：

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、第一方面：cd83+间充质干细胞在制备预防/治疗自身免疫性疾病和/或炎性相关疾病的药物中的应用。

4、基于mscs的异质性和功能可塑性，本技术团队认为mscs中存在抑炎和促炎易赋能亚群，且促/抑炎亚群平衡与炎症/免疫相关性疾病的转归和治疗抵抗相关。因此，若能明晰mscs抑炎和促炎易赋能亚群细胞表面标志和功能特征信息，后通过磁珠或者流式等分选技术获得高纯度mscs抑炎易赋能亚群，或者去除mscs促炎易赋能亚群的抑炎专能mscs，再以mscs抑炎易赋能亚群或者抑炎专能mscs为种子细胞，研发专治自身免疫/炎症相关性疾病的mscs细胞新药，将极大提高其临床疗效，具有更高成药性。为此，团队通过单细胞测序技术，发现了cd83阳性mscs亚群，且此亚群细胞对炎性因子介导的免疫抑制或者抑炎功能具有更敏感的抑炎赋能效应，并被定义为“免疫抑制或者抑炎易赋能cd83+-mscs亚群”，因此基于此亚群mscs细胞研发专治自身免疫/炎症相关性疾病的mscs细胞新药，将极大提高mscs的临床疗效，具有更高成药性。

5、另一个方面，cd83+过表达间充质干细胞在制备预防/治疗自身免疫性疾病和/或炎性相关疾病的药物中的应用；

6、在某些具体实施例中，所述cd83+间充质干细胞/cd83+过表达间充质干细胞能够增加抑炎因子和/或免疫抑制因子的分泌。

7、在某些具体的实施例中，所述免疫抑制因子为il-10、ido、pd-l1、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ中的至少一种；

8、在某些具体的实施例中，所述抑炎因子为il-10、ido、pd-l1、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ中的至少一种；

9、在某些具体实施例中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。

10、第二方面，一种前述应用中cd83+间充质干细胞/cd83+过表达间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)分离并培养间充质干细胞；

12、(2)采用抗cd83抗体偶联的磁珠分离和流式分选技术，或慢病毒基因转导技术，分选获免疫抑制或抑炎功能易赋能型天然cd83+间充质干细胞/cd83+过表达间充质干细胞。

13、具体为：方法一--磁珠和流式分选技术：采用抗cd83抗体偶联的磁珠和流式分选技术，分选获天然cd83+间充质干细胞，所述分选试剂包括抗cd83抗体偶联的磁珠或者cd83流式分选抗体；

14、或方法二--慢病毒等基因转导技术：采用慢病毒基因转导技术，获人cd83基因修饰的人造cd83+过表达间充质干细胞，所述人cd83基因转导技术包括不限于慢病毒、腺病毒和传统质粒表达载体等基因修饰转导技术；

15、优选地，其中所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血。

16、在某些具体的实施例中，步骤(1)中所述分离并培养间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；分离组织；将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重，转入离心管中离心，弃上清液；向离心管中加入mscs培养基，培养一段时间；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，消化解离并进行传代培养，获得含cd83+间充质干细胞的混合间充质干细胞群。

17、第三方面：cd83+pd-l1+间充质干细胞在制备预防/治疗自身免疫性疾病和/或炎性相关疾病的药物中的应用。

18、在某些具体的实施例中，所述cd83+pd-l1+间充质干细胞能够增强抑炎因子和/或免疫抑制因子的分泌。

19、在某些具体实施例中，所述免疫抑制因子为il-10、ido、pd-l1、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ中的至少一种；

20、在某些具体的实施例中，所述抑炎因子为il-10、ido、pd-l1、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ中的至少一种；

21、在某些具体实施例中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。

22、第四方面，一种cd83+pd-l1+间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：采用免疫因子诱导复合剂诱导培养前述cd83+间充质干细胞，获得免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞。

23、在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂包括ifn-υ和tnf-α免疫因子，所述ifn-υ的浓度为5-20ng/ml，所述tnf-α的浓度为0-20ng/ml。

24、进一步的，在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂包括ifn-υ和tnf-α免疫因子，所述ifn-υ的浓度为20ng/ml，所述tnf-α的浓度为5-20ng/ml。

25、在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂还包括白蛋白赋形剂。

26、在某些具体的实施例中，所述加入诱导复合剂的时机为：3-5代cd83+间充质干细胞增殖培养至70-80％细胞融合度时；

27、在某些具体的实施例中，所述诱导培养具体为：采用免疫因子诱导复合剂诱导cd83+间充质干细胞的诱导时间为18～24h，然后撤出所述诱导复合剂继续培养诱导后的cd83+间充质干细胞至少6h。

28、第五方面，一种根据前述制备方法制备得到的cd83+pd-l1+间充质干细胞的质量评估方法，将所述cd83+pd-l1+间充质干细胞内的cd83和pd-l1受体的阳性表达率作为所述cd83+pd-l1+间充质干细胞的质量控制指标。

29、在某些具体实施例中，所述cd83阳性表达率至少≥70％，所述pd-l1受体的阳性表达率≥30％。

30、一种试剂盒，所述试剂盒通过采用前述质量评估方法检测cd83和pd-l1受体的阳性表达率，可有效用于评价cd83+pd-l1+间充质干细胞的质量要求。

31、与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

32、1)本发明首次发现且验证了cd83+间充质干细胞，其对ifn-γ介导的抑炎因子的表达调控有更高的敏感性，表现为受ifn-γ刺激后表达更高的il-10、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ等抑炎因子，因此说明cd83+-mscs亚群对ifn-γ介导的mscs抑炎赋能具有更高敏感性，被认作抑炎易赋能亚群；另外，cd83+间充质干细胞受ifn-γ单独和/或联合tnf-α诱导后获得免疫抑制或者抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞，cd83+pd-l1+间充质干细胞可高表达pd-l1、ido、il-10、gdnf、il-10rα、il-2rγ、il-4、il-4r、il-17b、lif、gm-csfrα、timp-3和il-2rβ等免疫抑制或者抑炎因子，具有极强的免疫抑制或者抑炎功能；基于本发明，应用免疫抑制或者抑炎易赋能型cd83+-mscs或者基于其诱导获得的免疫抑制或者抑炎功能增强型cd83+pd-l1+-mscs治疗炎性或者免疫相关疾病，因这两种mscs细胞能高表达上述抑炎因子和/或免疫抑制因子，同时消除了促炎型mscs亚群的干扰，因此对免疫和炎性相关疾病的治疗发挥更好的免疫抑制和抑炎效应，致cd83+间充质干细胞/cd83+pd-l1+间充质干细胞治疗炎性或者免疫相关疾病具有更好的临床疗效；同时，应用类风湿性关节炎模型小鼠和clp模型脓毒症小鼠，临床前评估了此免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+-mscs/免疫抑制或抑炎功能易赋能型cd83+间充质干细胞/cd83+过表达间充质干细胞对免疫或者炎症相关疾病治疗的有效性和安全性，证实安全有效。

33、2)本发明还发现，单独应用ifn-γ即能够从转录水平上调cd83+-mscs细胞免疫抑制因子ido和免疫检查点受体pd-l1的表达，显著增强ifn-γ介导的mscs抑炎功能赋能效应；以及tnf-α联合ifn-γ处理cd83+-mscs细胞，能够同时从转录水平和翻译水平显著上调ido和pd-l1的蛋白表达，增强mscs的免疫调节和抑炎功能。本发明创新性提出利用tnf-γ和/或联合ifn-α诱导处理cd83+-mscs，同时从转录和翻译水平上调免疫抑制因子ido和免疫检查点受体pd-l1的表达，从不同角度提升mscs的免疫调节和抑炎能力，增强其对免疫和炎症相关疾病的治疗疗效。

34、3)本发明还通过采用抗cd83抗体偶联的磁珠分离和流式分选技术，或慢病毒基因转导技术，成功分选或者制备出了免疫抑制或抑炎功能易赋能型天然或者人工cd83+过表达间充质干细胞。同时在这个基础上，通过采用免疫因子诱导复合剂诱导培养前述cd83+间充质干细胞，成功获得免疫抑制或抑炎功能增强型cd83+pd-l1+间充质干细胞。

35、4)本发明创新性将免疫抑制或者抑炎功能增强型cd83+pd-l1+-mscs治疗脓毒症，可显著降低脓毒症的死亡率和炎症反应；治疗胶原诱导的关节炎也可显著改善小鼠关节炎的临床症状；同时，本发明根据抑炎型cd83+pd-l1+-mscs的诱导工艺流程，可进一步研发可简易推广应用的抑炎型cd83+pd-l1+-mscs诱导试剂盒。

36、5)本发明鉴于pd-l1信号在mscs抑炎功能中的作用以及其是一个极易通过流式技术快速检测的膜受体，因此检测pd-l1的表达可作为mscs抑炎功能评估的质量控制标准，为进一步研发可简易推广应用的抑炎型cd83+pd-l1+-mscs诱导试剂盒提供了技术支持。