一种评估乳腺癌患者CD8阳性T细胞抗肿瘤免疫的多基因模型及其构建方法

本发明涉及生物模型的构建，特别涉及一种评估乳腺癌患者cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫的多基因模型及其构建方法。

背景技术：

1、肿瘤的免疫冷/热分型是影响肿瘤患者预后以及免疫治疗疗效的关键因素。理论上，免疫热肿瘤的患者有着更好的抗肿瘤能力，更容易从免疫治疗中获益。但在目前的临床实践中，肿瘤的免疫冷/热分型是由淋巴细胞的浸润水平来决定的，而肿瘤微环境中既存在发挥抗肿瘤免疫的淋巴细胞，也存在抑制免疫的淋巴细胞，因此，以淋巴细胞浸润水平为标准实际上并不能反映患者真正的肿瘤免疫冷/热情况。但目前尚没有其他可用的诊断工具以用于在临床实践中准确评估肿瘤的免疫冷/热情况。

2、cd8阳性t细胞在抗肿瘤免疫中承担关键角色，准确评估其抗肿瘤能力即可很大程度上反映肿瘤的免疫冷/热。但过往一些评估手段，如cd8阳性t细胞丰度、细胞毒性评分和干扰素γ通路得分等均无法准确地评估cd8阳性t细胞的抗肿瘤免疫情况，由此导致其在乳腺癌的预后以及免疫治疗疗效的预测上表现不佳。cd8阳性t细胞介导的抗肿瘤免疫，与其肿瘤识别、细胞杀伤、免疫因子分泌、增殖以及抵抗死亡的能力密切相关，综合多个维度的功能才能更全面且精准地评估cd8阳性t细胞的抗肿瘤免疫。但目前尚没有一个可以综合多个cd8阳性t细胞功能维度以量化其抗肿瘤免疫的评估工具，以在临床上更好地预测乳腺癌预后以及免疫治疗疗效。

3、近年来，多种高精度解析微环境的技术手段被开发使用，如单细胞测序，能更精确地评估微环境组分的功能。但这些技术手段成本较高，不适用于大规模的临床实践。临床实际情况出发，开发一种成本更低、高通量且操作简单的用于评估乳腺癌患者cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫的多基因模型对于乳腺癌的风险预测、免疫治疗疗效和预后评估都具有极为重要的意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种评估乳腺癌患者cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫的多基因模型及其构建方法。本发明中的多基因模型能够从多维度出发，准确评估微环境中cd8阳性t细胞的识别肿瘤、杀伤肿瘤、免疫因子分泌、增殖以及抵抗死亡(凋亡)5个功能维度，并通过加权整合的方式计算一个得分来量化cd8阳性t细胞总体的抗肿瘤免疫，以在临床上更准确预测乳腺癌预后以及免疫治疗疗效。

2、本发明的第一个方面，提供一种多基因cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫模型的构建方法，包括如下步骤：

3、(1)提取检测样品中的核酸，定量检测肿瘤识别、细胞毒性、ifn-gama分泌、增值和凋亡相关基因的表达量，并基于表达量计算肿瘤识别、细胞毒性、ifn-gama分泌、增值和凋亡维度的得分；

4、(2)根据肿瘤识别、细胞毒性、ifn-gama分泌、增值和凋亡维度的得分，构建抗肿瘤免疫评分公式，得到多基因cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫模型；

5、其中，对于早期乳腺癌：

6、抗肿瘤免疫评分为：1×肿瘤识别得分+0.2×细胞毒性得分+0.2×ifn-gama分泌得分+0.1×增殖得分+凋亡得分×1。

7、对于晚期乳腺癌：

8、抗肿瘤免疫评分为：0.3×肿瘤识别得分+0.8×细胞毒性得分+0.7×ifn-gama分泌得分+0.1×增殖得分+凋亡得分×0.9。

9、其中，所述早期乳腺癌为临床分期i-iii期的乳腺癌，所述晚期乳腺癌为临床分期iv期的乳腺癌。

10、在本发明的一些实施方式中，肿瘤识别相关基因由正相关基因和负相关基因组成，其中，正相关基因包括hla-dqb1、rnf19a、c12orf75、b4galt5、optn、r3hdm1、ubd、marco、cxcr6、khdrbs1、cd8b、runx3、zfp69b、ccdc65和gbp1；负相关基因包括coa3、tmem54、scnn1a、rhod、adirf和usp27x-as1。

11、在本发明的一些实施方式中，细胞毒性相关基因由正相关基因和负相关基因组成，其中，正相关基因包括hla-dqb1、rnf19a、c12orf75、faslg、znf683、cst1、grap2、gbp2、fnbp1、gzma、grsf1、ikzf4和ccdc59；负相关基因包括prss22、mpc2、nt5c3b、jph1和usp27x-as1。

12、在本发明的一些实施方式中，ifn-gama分泌相关基因由正相关基因和负相关基因组成，其中，正相关基因包括hla-dqb1、b4galt5、optn、faslg、znf683、cst1、cd8a、hla-dqa1、gpa33、miip、ccr5、fpr3、uxs1、lag3和il15；负相关基因包括celsr2和usp27x-as1。

13、在本发明的一些实施方式中，增值相关基因由正相关基因和负相关基因组成，其中，正相关基因包括rnf19a、b4galt5、optn、r3hdm1、ubd、cd8a、hla-dqa1、yme1l1；负相关基因包括nt5c3b、jph1和adirf。

14、在本发明的一些实施方式中，凋亡由正相关基因和负相关基因组成，其中，正相关基因包括包括hla-dqb1、b4galt5、optn、marco、cd8a、gpa33、cd70、gzmb、plcg1、hspa8、akirin1和jsrp1；负相关基因包括agr3、trim45、klc4、med20和mpc2。

15、在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤识别、细胞毒性、ifn-gama分泌、增值和凋亡维度的得分的计算方式为：

16、得分＝维度的正相关基因的平均表达量-负相关基因的平均表达量。

17、在本发明的一些实施方式中，各维度的得分具体为：

18、肿瘤识别得分＝(hla-dqb1+rnf19a+c12orf75+b4galt5+optn+r3hdm1+ubd+marco+cxcr6+khdrbs1+cd8b+runx3+zfp69b+ccdc65+gbp1的表达量)/15-(coa3+tmem54+scnn1a+rhod+adirf+usp27x-as1的表达量)/6；

19、细胞毒性得分＝(hla-dqb1+rnf19a+c12orf75+faslg+znf683+cst1+grap2+gbp2+fnbp1+gzma+grsf1+ikzf4+ccdc59的表达量)/13-(prss22+mpc2+nt5c3b+jph1+usp27x-as1的表达量)/5；

20、ifn-gama分泌得分＝(hla-dqb1+b4galt5+optn+faslg+znf683+cst1+cd8a+hla-dqa1+gpa33+miip+ccr5+fpr3+uxs1+lag3+il15的表达量)/15-(celsr2+usp27x-as1的表达量)/2；

21、增殖得分＝(rnf19a+b4galt5+optn+r3hdm1+ubd+cd8a+hla-dqa1+yme1l1的表达量)/8-(nt5c3b+jph1+adirf的表达量)/3；

22、凋亡得分＝(hla-dqb1+b4galt5+optn+marco+cd8a+gpa33+cd70+gzmb+plcg1+hspa8+akirin1+jsrp1的表达量)/12-(agr3+trim45+klc4+med20+mpc2的表达量)/5。

23、本发明的第二个方面，提供一种乳腺癌预后和/或治疗效果评估产品，所述乳腺癌预后和/或治疗效果评估产品包括基因表达量定量模块和分析模块；所述分析模块中载有本发明第一个方面中的肿瘤识别、细胞毒性、ifn-gama分泌、增值和凋亡维度的得分的计算算法和抗肿瘤免疫评分算法。

24、在本发明的一些实施方式中，所述基因表达量定量模块用于定量待测样品中目标基因的表达量。

25、在本发明的一些实施方式中，所述基因表达量定量模块包括本领域的常规定量方法和产品。

26、在本发明的一些实施方式中，所述基因表达量定量模块包括但不限于定量pcr法、荧光原位杂交法(fish)、测序和实时荧光定量pcr法(qpcr)。

27、在本发明的一些实施方式中，所述基因表达量定量模块包括但不限于市售检测试剂盒、检测试剂、检测芯片。

28、在本发明的一些实施方式中，所述基因表达量定量模块的使用方法按照所选择的具体方法和产品决定，如对于具体方法，可参考本领域技术手册；对于产品，可参考产品的说明书进行。

29、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的多基因cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫模型的构建方法在乳腺癌预后和/或治疗效果评估中的应用。

30、在本发明的一些实施方式中，所述乳腺癌预后和/或治疗效果与抗肿瘤免疫评分的对应关系为：

31、当抗肿瘤免疫评分大于等于-0.111时，预测该样本对于免疫治疗疗效具有响应性，且乳腺癌预后前景佳；

32、当抗肿瘤免疫评分小于-0.111时，预测该样本对于免疫治疗疗效响应性低或无响应，乳腺癌预后前景差。

33、在本发明中，所用的多基因模型是基于转录组测序/芯片技术实现的，因此，成本较低且重复性较好，能够有效适用于临床应用。而且，在本发明中，该多基因模型通过结合单细胞测序和转录组测序技术实现多角度训练得到，能够有效反映cd8阳性t细胞不同功能维度，并在加权整合后可量化cd8阳性t细胞抗肿瘤免疫，从而在临床上更为准确的预测乳腺癌预后以及免疫治疗疗效。

34、本发明的有益效果是：

35、1.本发明的多基因模型对于乳腺癌患者的预后具有良好的预测效果，在临床实例中以及公知的两个独立的大型乳腺癌队列(tcga-brca和metabric)中均能有效预测乳腺癌患者的预后；而且优于传统的淋巴细胞浸润、cd8阳性t细胞浸润以及免疫激活相关模型。

36、2.本发明的多基因模型可有效预测乳腺癌患者的免疫治疗疗效，并在临床实例中展示出获得临床获益的患者cd8阳性t细胞整体抗肿瘤免疫评分显著高于未获得临床获益的患者的对应性关系。而且，在另外3个独立的临床试验中，cd8阳性t细胞整体抗肿瘤免疫评分均能有效预测乳腺癌患者的免疫治疗获益，auc分别为0.822、0.782和0.710，明显优于其他预测乳腺癌免疫治疗疗效的指标如：tis、geparsixto和cd8阳性t细胞浸润水平等。