一种脱细胞组织基质水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料，具体涉及一种脱细胞组织基质水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、在组织重建和整形外科领域，软组织缺损的填充修复一直是一个困扰外科医生的棘手问题。从1981年fda批准的zyderm胶原蛋白到如今的透明质酸类产品，多种真皮填充产品陆续上市。最受欢迎的产品透明质酸是线性、无支链、高分子质量的糖胺聚糖复合糖，由交替的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖组成。在自然状态下，透明质酸是一种理想的填充材料，但其半衰期非常短，严重限制了其临床使用。为了延长透明质酸在体内的耐久性并增强其机械性能，通过加入多官能试剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、二乙烯基砜、1,2,7,8-二环氧辛烷、聚乙二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚进行化学交联形成水凝胶。但在某些美容治疗中，注射透明质酸会引起严重的肉芽肿性过敏反应。因此，亟需开发一种不易流动、体内存续时间长、无不良反应的皮肤填充物用于临床。组织工程化真皮组织因其生物特性被认为更适用于对软组织的修复重建，其中脱细胞真皮细胞外基质已成为当前的研究热点。

2、皮肤修复和填充受制于其不规则空间的特点，而水凝胶这一物理形态能很好地填充不规则伤口，并且水凝胶支架具有生物相容性高、生物降解速度可控的优点。

3、脱细胞组织基质（acellular tissue matrix）是用适当的方法将组织/器官进行脱细胞处理，去除组织中可能引起排斥反应的细胞及其他抗原分子，保留3维结构（胶原和弹性蛋白）和功能蛋白（如葡萄氨基葡聚糖、蛋白聚糖和生长因子等），具有生物诱导功能，可以在体内/体外形成特定的功能化组织，可用于组织损伤修复/重建的一种新型生物材料。

4、脱细胞真皮基质水凝胶结合了异种脱细胞真皮来源广、免疫原性低和水凝胶制剂两者的优势，成为组织修复应用的良好策略。脱细胞基质水凝胶不仅可用于组织工程的修复和再生，还有很多其他应用，可进行3d细胞和类器官的培养，也可为药物、生长因子和其他治疗剂构建生物相容的输送系统，将具有很好的医学应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种脱细胞组织基质水凝胶及其制备方法和应用，制备过程中，无需添加化学交联剂，减少了有毒化合物的使用，提高了水凝胶的生物相容性，降低了细胞毒性，并使其形成独特的多孔结构，为宿主细胞的迁移、黏附、增殖和分化提供物理条件，改善了水凝胶的溶胀性能，可应用于伤口敷料、皮肤修复材料、皮肤组织材料等领域。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种脱细胞组织基质水凝胶的制备方法，将猪皮经过脱细胞处理，漂洗，酶解后获得脱细胞胶原蛋白肽，与负载奎宁的改性透明质酸钠混合溶于pbs溶于中，反复冻融，制得脱细胞组织基质水凝胶。

4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

5、s1.脱细胞处理：将猪皮经过清洗、脱毛、绞碎，浸泡于含有十二烷基硫酸钠的溶液中，振荡反应，过滤，清水漂洗，制得脱细胞真皮基质材料；

6、s2.十二烷基硫酸钠的漂洗：将步骤s1制得的脱细胞真皮基质材料加入乙醇和赖氨酸钾混合溶液中，浸泡，过滤，洗涤，干燥，制得洁净脱细胞真皮基质材料；

7、s3.胶原蛋白的酶解：将步骤s2制得的洁净脱细胞真皮基质材料加入水中，调节为第一ph值，加入第一蛋白酶酶解，然后调节为第二ph值，加入第二蛋白酶酶解至基本溶解，灭酶，过滤，滤液冷冻干燥，得到脱细胞胶原蛋白肽；

8、s4.改性透明质酸钠的制备：将透明质酸钠溶于pbs溶液中，加入单宁酸和催化剂，加热搅拌反应，透析，冷冻干燥，然后将产物溶于pbs溶液中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂，加热搅拌反应，透析，冷冻干燥，制得改性透明质酸钠；

9、s5.负载奎宁的改性透明质酸钠的制备：将步骤s4制得的改性透明质酸钠溶于pbs溶液中，加入盐酸奎宁，搅拌混合均匀，冷冻干燥，制得负载奎宁的改性透明质酸钠；

10、s6.水凝胶的制备：将步骤s3制得的脱细胞胶原蛋白肽和步骤s5制得的负载奎宁的改性透明质酸钠溶于pbs溶液中，孵育，形成水凝胶；

11、s7.脱细胞组织基质水凝胶的制备：将步骤s6制得的水凝胶进行反复冻融，制得脱细胞组织基质水凝胶。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述含有十二烷基硫酸钠的溶液的浓度为0.5-1wt%，所述振荡反应的温度为20-25℃，时间为15-20h；步骤s2中所述乙醇和赖氨酸钾混合溶液中乙醇、赖氨酸钾和水的质量比为25-30:3-5:50-60，所述浸泡时间为1-3h。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述第一ph值为1.5-2，所述第一蛋白酶为胃蛋白酶，所述第二ph值为7-8，所述第二蛋白酶为糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:7-10，所述洁净脱细胞真皮基质材料、第一蛋白酶、第二蛋白酶的质量比为100:3-5:5-7。

14、作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述pbs溶液为ph=7.2-7.5的pbs溶液，所述透明质酸钠、单宁酸和催化剂的质量比为12-15:5-7:0.5-1，所述产物、多巴胺盐酸盐和催化剂的质量比为15-17:5-7:0.5-1，所述催化剂为ph=8.5-9的tris-hcl溶液，所述加热搅拌反应的温度为35-40℃，时间为3-5h，所述透析用的透析袋孔径为2-3kda，透析时间为3-5h。

15、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述pbs溶液为ph=7.2-7.5的pbs溶液，所述改性透明质酸钠、盐酸奎宁的质量比为20-25:3-5。

16、作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述脱细胞胶原蛋白肽、负载奎宁的改性透明质酸钠的质量比为12-15:17-20，所述pbs溶液为ph=7.2-7.5的pbs溶液，所述孵育的温度为36-38℃，时间为3-5h；步骤s7中所述反复冻融的方法为将水凝胶置于-20至-25℃，冷冻1-3h，室温融化，重复操作5-7次。

17、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

18、s1.脱细胞处理：将猪皮经过清洗、脱毛、绞碎，浸泡于0.5-1wt%十二烷基硫酸钠溶液中，20-25℃振荡反应15-20h，过滤，清水漂洗，制得脱细胞真皮基质材料；

19、s2.十二烷基硫酸钠的漂洗：将10重量份步骤s1制得的脱细胞真皮基质材料加入100重量份乙醇和赖氨酸钾混合溶液中，浸泡1-3h，过滤，洗涤，干燥，制得洁净脱细胞真皮基质材料；

20、所述乙醇和赖氨酸钾混合溶液中乙醇、赖氨酸钾和水的质量比为25-30:3-5:50-60；

21、s3.胶原蛋白的酶解：将100重量份步骤s2制得的洁净脱细胞真皮基质材料加入500重量份水中，调节ph值为1.5-2，加入3-5重量份胃蛋白酶，35-37℃酶解2-4h，然后调节ph值为7-8，加入第二蛋白酶，36-38℃酶解3-5h，调节ph值为中性，微波灭酶，过滤，滤液冷冻干燥，得到脱细胞胶原蛋白肽；

22、所述第二蛋白酶为糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:7-10；

23、s4.改性透明质酸钠的制备：将12-15重量份透明质酸钠溶于100重量份ph=7.2-7.5的pbs溶液中，加入5-7重量份单宁酸和0.5-1重量份催化剂，加热至35-40℃，搅拌反应3-5h，用孔径为2-3kda的透析袋透析3-5h，冷冻干燥，然后将15-17重量份产物溶于100重量份ph=7.2-7.5的pbs溶液中，加入5-7重量份多巴胺盐酸盐和0.5-1重量份催化剂，加热至35-40℃，搅拌反应3-5h，用孔径为2-3kda的透析袋透析3-5h，冷冻干燥，制得改性透明质酸钠；

24、所述催化剂为ph=8.5-9的tris-hcl溶液；

25、s5.负载奎宁的改性透明质酸钠的制备：将20-25重量份步骤s4制得的改性透明质酸钠溶于200重量份ph=7.2-7.5的pbs溶液中，加入3-5重量份盐酸奎宁，搅拌混合15-20min，冷冻干燥，制得负载奎宁的改性透明质酸钠；

26、s6.水凝胶的制备：将12-15重量份步骤s3制得的脱细胞胶原蛋白肽和17-20重量份步骤s5制得的负载奎宁的改性透明质酸钠溶于200重量份ph=7.2-7.5的pbs溶液中，36-38℃孵育3-5h，形成水凝胶；

27、s7.脱细胞组织基质水凝胶的制备：将步骤s6制得的水凝胶置于-20至-25℃，冷冻1-3h，室温融化，重复操作5-7次，制得脱细胞组织基质水凝胶。

28、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的脱细胞组织基质水凝胶。

29、本发明进一步保护一种上述脱细胞组织基质水凝胶在制备皮肤敷料、皮肤修复材料、皮肤组织材料中的应用。

30、本发明具有如下有益效果：

31、水凝胶是高度水合的高分子聚合物材料，通过聚合物链之间的物理和化学交联来保持结构的完整。作为高度水合的三维聚合网络，水凝胶在结构和物理特性方面表现出与天然细胞外基质的高度相似，因此，其具有很好的生物相容性和细胞低毒性。

32、本发明脱细胞组织基质水凝胶将猪皮经过十二烷基硫酸钠脱细胞处理，十二烷基硫酸钠能够结合细胞膜蛋白，短时间内破坏细胞膜和核膜，具有脱除效率高，不会引起免疫反应，对细胞外基质损伤小的特点。但是，如果脱细胞组织不能很好的去除残余的十二烷基硫酸钠，长期与其接触后，会导致蛋白质变性并破坏其三维结构，因此，本发明还进一步将脱细胞真皮基质材料浸泡在乙醇和赖氨酸钾混合溶液对十二烷基硫酸钠进行漂洗、脱除，从而避免对脱细胞真皮基质材料的进一步破坏。其中，采用乙醇的清洗，利用了十二烷基硫酸钠微溶于乙醇而易溶于水的特性，同时，乙醇降低溶液的表面张力，有助于将清洗剂完全渗透入组织中。采用赖氨酸钾溶液清洗，利用了十二烷基硫酸钠一方面能够与k+生成沉淀从而被清洗去除，同时，高介电常数会降低十二烷基硫酸钠的临界胶束浓度，使得其易于沉淀析出，同时，赖氨酸的结构，与脱细胞真皮基质材料的蛋白结构相似，不易发生免疫反应，对脱细胞真皮基质材料安全无伤害。

33、随后，将制得的洁净脱细胞真皮基质材料，在胃蛋白酶的一级酶解和糜蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶解作用下，分解成的小分子肽或肽段，制得的包括了小分子胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、生长因子和其他细胞外基质组分的分解产物的脱细胞胶原蛋白肽，这种复杂的混合物结构，可以在37℃的条件下自组装形成的水凝胶，形成蛋白肽交联网络。

34、本发明另外制备了一种负载奎宁的改性透明质酸钠，通过单宁酸和聚多巴胺改性透明质酸钠，在透明质酸钠结构上连接了单宁酸和聚多巴胺，同时，负载了高活性物质奎宁，单宁酸和奎宁能够抑制炎症过程中免疫细胞的活化，抑制炎症小体的产生，从而使得制得的脱细胞组织基质水凝胶有很好的抗炎抗氧化性能，能够减少进入人体后的炎症反应，两者具有协同增效的作用。同时，单宁酸和聚多巴胺的改性，两者可以通过羧基、氨基等氢键的键连，形成透明质酸钠的高分子网络。

35、将脱细胞胶原蛋白肽和负载奎宁的改性透明质酸钠混合后孵育，一方面脱细胞胶原蛋白肽和负载奎宁的改性透明质酸钠单独可以自组装形成水凝胶，同时，脱细胞胶原蛋白肽和负载奎宁的改性透明质酸钠相互之间也能够通过形成氢键等化学键形成更复杂的多交联网络，从而大大提高了制得的脱细胞组织基质水凝胶的交联度，从而解决了单独透明质酸钠半衰期短，容易降解等问题。

36、进一步将形成的水凝胶经过反复冻融，通过物理手段，大大提高了水凝胶体系的交联度，改善凝胶的力学性能，改善聚合物链中并排缔合特殊结构的形成。

37、本发明脱细胞组织基质水凝胶的制备过程中，无需添加化学交联剂，减少了有毒化合物的使用，提高了水凝胶的生物相容性，降低了细胞毒性，并使其形成独特的多孔结构，为宿主细胞的迁移、黏附、增殖和分化提供物理条件，改善了水凝胶的溶胀性能，可应用于伤口敷料、皮肤修复材料、皮肤组织材料等领域。