甲硫氨酸类化合物在制备PCSK9抑制剂中的应用

本发明涉及pcsk9抑制剂，具体涉及甲硫氨酸类化合物在制备pcsk9抑制剂中的应用。

背景技术：

1、心脑血管疾病是全球主要的死亡原因，而动脉粥样硬化和高血脂是导致心脑血管疾病的核心因素。心脑血管疾病一级和二级预防中，降低血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl c)可有效控制高血脂和动脉粥样硬化，进一步降低心血管事件发病风险。在正常生理情况下，血液经过肝脏时，肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(ldlr)会结合ldl-c，转运ldl-c到胞内降解，之后ldlr会返回肝脏细胞表面，去结合更多循环中的ldl c颗粒，进一步降低血浆ldl-c的水平。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexintype 9，pcsk9)主要是由肝细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，近年来被报道是导致血中ldl-c升高的重要分子。其主要通过与ldlr结合，阻止ldlr再循环到肝脏细胞表面，从而导致血清中ldl-c无法被降解，ldl-c堆积，进一步导致动脉粥样硬化和心脑血管疾病发生。因此，开发pcsk9抑制剂即可降低血清ldl-c水平。目前pcsk9抑制剂阿利西尤单抗、依洛尤单抗两种注射型制剂已经上市用于原发性高胆固醇血症、混合型血脂异常、动脉粥样硬化性心血管疾病治疗。

2、目前，上市的pcsk9抑制剂注射制剂有抗体类药物依洛尤单抗和阿利西尤单抗，rna干扰药物英克西兰；口服制剂进入临床试验阶段的有靶向抑制肝细胞内pcsk9 mrna的翻译和蛋白合成的反义寡核苷酸azd8233和可口服的小分子多肽nnc0385-0434和mk-0616。上述pcsk9抑制剂皆为生物类药物，存在诸多缺陷，如提纯工艺复杂、生产成本高、售价高、运输储藏要求高；注射制剂使用不便、患者依从性差，单抗、多肽类药物容易引起机体产生药物抗体、增加副作用风险，反义寡核苷酸极不稳定，疗效个体差异大。与上述抗体或多肽药物相比，小分子药物具有无免疫原性、更高的口服生物利用度、开发成本低、运输储藏要求低等优势，因此，开发pcsk9的小分子抑制剂具有重大的临床价值。但由于pcsk9与ldlr结合区平坦光滑，无有效的药物结合的结构域，开发阻断pcsk9与ldlr结合的小分子抑制剂一直是行业难题，导致目前尚无pcsk9的小分子抑制剂上市。

技术实现思路

1、本发明意在提供甲硫氨酸类化合物在制备pcsk9抑制剂中的应用，以解决现有技术中缺少pcsk9的小分子抑制剂的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、甲硫氨酸类化合物在制备pcsk9抑制剂中的应用。

4、进一步，所述甲硫氨酸类化合物选自如式(1)-式(13)所示的化合物中的至少一种：

5、

6、进一步，所述pcsk9抑制剂包括甲硫氨酸类化合物和甲硫氨酸类化合物在药学上可接受的盐、水合物、包合物、溶剂化物、异构体、前药中的至少一种。

7、进一步，所述pcsk9抑制剂负载于载体上或者混合有赋形剂。

8、进一步，所述pcsk9抑制剂的给药方式为口服给药或者胃肠道外给药；所述胃肠道外给药包括皮下注射、静脉注射和肌肉注射。

9、进一步，所述甲硫氨酸类化合物用于治疗pcsk9介导的疾病或障碍；pcsk9介导的疾病或障碍为血清低密度脂蛋白胆固醇升高的疾病、动脉粥样硬化性心血管病、实体肿瘤和血液系统肿瘤中的一种。

10、进一步，甲硫氨酸类化合物在血清低密度脂蛋白胆固醇升高的疾病中的适用情况为：他汀类药物治疗28天及以上空腹血清低密度脂蛋白胆固醇仍然大于2.6mmol/l或者100mg/dl的血清低密度脂蛋白胆固醇升高患者；

11、甲硫氨酸类化合物在动脉粥样硬化性心血管病中的适用情况为：按2023年版中国血脂管理指南规定，动脉粥样硬化性心血管病极高危人群，接受他汀类药物治疗28天及以上，空腹血清低密度脂蛋白胆固醇仍然大于1.8mmol/l或者70mg/dl的患者；动脉粥样硬化性心血管病超高危人群，接受他汀类药物治疗28天及以上，空腹血清低密度脂蛋白胆固醇仍然大于1.4mmol/l或者55mg/dl的患者；

12、根据2023年版中国血脂管理指南，针对血清低密度脂蛋白胆固醇升高的疾病、动脉粥样硬化性心血管病患者，需要采用降血清低密度脂蛋白胆固醇的治疗手段，并使用相应药物。本技术方案验证了甲硫氨酸类化合物具有降低血清低密度脂蛋白胆固醇的功效，因此，可以用于上述的治疗方案。

13、甲硫氨酸类化合物在实体肿瘤和血液系统肿瘤中的适用情况为：血清pcsk9含量≥200ng/ml的实体肿瘤或血液系统肿瘤。

14、对于肿瘤治疗，部分癌症患者存在pcsk9蛋白表达量上调的情况，引起自身抗肿瘤免疫抑制，同时引起血清低密度脂蛋白胆固醇的代谢失调，影响患者生存质量。针对出现pcsk9蛋白表达量上调的癌症患者(实体肿瘤和血液系统肿瘤)，可使用pcsk9抑制剂进行治疗。而本方案研究发现甲硫氨酸类化合物是一种有效的pcsk9抑制剂，可应用与上述医疗场景中，在对pcsk9蛋白量进行抑制的同时，实现甲硫氨酸类化合物的癌症治疗效果，从两个方面改善患者生存质量。特别是针对血清pcsk9含量≥200ng/ml的实体肿瘤或血液系统肿瘤患者，由于这类患者体内pcsk9蛋白表达量过高引起的免疫抑制和严重的脂代谢失常，甲硫氨酸类化合物的使用尤其具有实际意义。人群中有天然不表达pcsk9的个体，或者癌症患者的pcsk9表达低下，这种情况下，就没有必要使用甲硫氨酸类化合物对此类癌症进行治疗。因此，对血清pcsk9含量的筛选，在其较高的情况下，才使用甲硫氨酸类化合物进行癌症治疗，保证了治疗效率以及对症下药。

15、进一步，所述甲硫氨酸类化合物用于与预防或治疗高血脂症及相关代谢性疾病或癌症的药物联合使用；

16、预防或治疗高血脂症及相关代谢性疾病或癌症的药物包括但不限于下列药物：

17、(1)降血脂药物：他汀类药物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀和匹伐他汀等)、胆固醇吸收抑制剂(如依折麦布等)、贝特类药物(如氯贝特、苯扎贝特、非诺贝特等)、胆汁酸吸收剂(如括考来烯胺、考来替泊和盐酸考来维仑等)、acl抑制剂(bempedoic acid等)、angptl3抑制剂(evinacumab等)、pcsk9抑制剂(依洛尤单抗、阿利西尤单抗、英克西兰、azd8233、nnc0385-0434、mk-0616等)、微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂(lomitapide等)。

18、(2)抗糖尿病药物：胰岛素、二甲双胍、葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等)、pparγ激动剂(如吡格列酮和罗格列酮等)、pparα/γ双重激动剂、磺酰脲类(如格列苯脲、格列美脲、格列齐特、格列喹酮等)、二肽基肽酶iv(dpp-4)抑制剂(如西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀、复格列汀、利格列汀等)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)类激动剂(如司美格鲁肽、艾塞那肽、贝那鲁肽、利司那肽、利拉鲁肽、杜拉糖肽、洛赛那肽等)、格列奈类降糖药(如瑞格列奈、那格列奈、米格列奈等)、sglt2抑制剂(如达格列净、恩格列净、卡格列净、艾托格列净片、鲁格列净等)、葡萄糖激酶激动剂(如多扎格列亚汀等)、糖原磷酸化酶抑制剂、gpr120激动剂、gpr40激动剂、ptp1b抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂等。

19、(3)抗非酒精性脂肪性肝病药物：包括二甲双胍、法尼酯x受体(fxr)激动剂(如奥贝胆酸、asc42、tern-101、tropifexor、nidufexor、cilofexor等)、ppar激动剂(如saroglitazar、elafibranor、lanifibranor等)、成纤维细胞生长因子21(fgf21)类似物(efruxifermin、aalafermin等)、glp-1激动剂(如semaglutide等)、胆汁酸转运体(ibat)抑制剂(elobixibat等)、凋亡信号调节激酶-1(ask1)抑制剂(如selonsertib等)、硬脂酰辅酶a去饱和酶1(scd1)抑制剂(如aramchol等)、ccr5r阻断剂(如cenicriviroc等)、甲状腺激素受体β(thr-β)激动剂(如resmetirom等)、脂肪酸合成酶抑制剂(如denifanstat等)。

20、(4)减肥药物：包括奥利司他、氯卡色林、glp-1类激动剂(如司美格鲁肽、艾塞那肽、贝那鲁肽、利司那肽、利拉鲁肽、杜拉糖肽、洛赛那肽等)。

21、(5)抗癌药物：化疗药物(如环磷酰胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂、白消安、塞替派类、丝裂霉素、甲氨蝶呤、培美曲塞、氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、表柔比星、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、紫杉类、长春碱类、艾日布林、门冬酰胺酶)；小分子靶向药(egfr抑制剂：吉非替尼，厄洛替尼、埃克替尼，奥希替尼、阿美替尼、伏美替尼等、alk抑制剂：克唑替尼、阿来替尼、劳拉替尼等、mek抑制剂：曲美替尼等、her2抑制剂：拉帕替尼、呲咯替尼、奈拉替尼，妥卡替尼等、parp抑制剂：奥拉帕利，尼拉帕利、氟唑帕利等、mtor抑制剂：依维莫司等、hdac抑制剂：西达本胺等、bcr-abl抑制剂：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、普纳替尼等、met抑制剂：赛沃替尼、卡马替尼等、ret抑制剂：普拉替尼、braf抑制剂：达拉非尼、维莫非尼，encorafenib等、cdk4/6抑制剂：呱柏西利、阿贝西利等、ntrk抑制剂：拉罗替尼、恩曲替尼等、btk抑制剂：伊布替尼、泽布替尼等、jak抑制剂：芦可替尼等、pi3k抑制剂：alpelisib等、抗血管多激酶抑制剂：安罗替尼、阿帕替尼，仑伐替尼，阿昔替尼、舒尼替尼、卡博替尼、瑞戈非尼、索拉非尼等、pdgfr/c-kit抑制剂：伊马替尼，尼洛替尼、阿伐替尼等、蛋白酶抑制剂：硼替佐米，伊沙佐米等、fgfr2抑制剂：pemigatinib等、idh1抑制剂：ivosidenib等、核转运蛋白抑制剂：selinexor等)；抗体靶向药物(anti-her2：曲妥珠单抗，帕妥珠单抗、zw25、kn026等、anti-egfr：西妥昔单抗、尼妥珠单抗等、anti-vegf：贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、人内皮抑制素等、anti-cd20：利妥昔单抗等、anti-cd38：达雷妥尤单抗等、anti-cd19-cd3：blinatumomab等、anti-egfr-met：jnj-372等、anti-dll4-vegf：navicixizumab等)；免疫检查点抑制剂(anti pd1：纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗等、anti-pdl1：阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、舒格利单抗、阿维单抗等、anti-ctla4：伊匹木单抗等、anti-lag3：瑞拉利单抗等、anti-tigit：mk-7684a等、anti-pd1/clta4：kn046、xmab20717、cadonilimab等、anti-pd-1/tim-3：ro-7121661等、anti-pd1/cd27：cdx-527等、anti-pdl1/tgfb：js201等、anti-pd1/pdl1：reozalimab、ib1318等、anti-pd-1/vegf：ivonescimab等、anti-pd-1/her2：fidasimtamab等)；免疫调节剂(如沙利度胺、来那度胺、胸腺肽、维甲酸等)；抗体-药物偶联剂(维布妥昔单抗、u3-1402、恩美曲妥珠单抗等)；激素类(他莫昔芬、托瑞米芬、来曲唑、阿那曲唑、恩杂鲁胺、比卡鲁胺、阿比特龙等)；细胞疗法(car-t、car-nk等)。

22、进一步，所述甲硫氨酸类化合物用于抑制pcsk9基因的转录或者下调pcsk9蛋白的表达量。

23、本方案还提供了甲硫氨酸类化合物在制备用于降低血清低密度脂蛋白胆固醇的药物、或者抗肿瘤药物、或者激活肿瘤免疫的药物中的应用。

24、采用上述技术方案的原理：

25、本发明从调控pcsk9基因表达出发，前期设计了pcsk9启动子融合tdtomato表达质粒，完成了大规模的新药发现高通量筛选库的小分子药物筛选，最终发现一类具有甲硫氨酸结构的化合物可在体外细胞实验有效抑制pcsk9基因转录，并在动物实验体内验证了该类化合物作为pcsk9抑制剂，可有效降低小鼠血清中ldl-c水平，抑制移植瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期，同时未见小鼠有明显毒副作用发生。因此，如式(1)-式(13)所示的甲硫氨酸类化合物，可作为pcsk9的小分子抑制剂进行广泛应用。

26、现有技术关于甲硫氨酸的功效研究，具体情况如下：甲硫氨酸，又名蛋氨酸，是构成人体的必需氨基酸之一。有报道，含0.1％(w/w)甲硫氨酸添加食物可抑制高脂饮食导致的小鼠体重增加，并降低血清胆固醇和甘油三酯水平；但0.2％(w/w)及更高的甲硫氨酸添加食物对高脂饮食导致的体重增加、血清胆固醇和甘油三酯水平无影响(chiba,etal.plos one,2016)。也有报道，甲硫氨酸添加食物摄入可导致小鼠血清胆固醇、ldl-c、甘油三酯增加(jin et al.front cardiovasc med,2021；hirche et al.british journalof nutrition,2006)。因此，甲硫氨酸对血脂的影响尚存在争议。

27、在癌症治疗方面，有报道甲硫氨酸缺乏饮食可抑制结肠癌移植瘤生长，且在免疫细胞健全的小鼠中更加明显，并与anti-pd1疗法产生协同抗肿瘤活性(li et al.gut,2023)。甲硫氨酸缺乏导致肿瘤细胞周期阻滞在g2期，引起dna损伤，可有效抑制肿瘤生长(wanders，et al.nutrients.2020)。甲硫氨酸缺乏饮食可抑制神经胶质瘤生长，延长小鼠生存时间(golbourn et al.nat cancer,2022)。但相反报道也很多，甲硫氨酸被报道对肿瘤和t细胞功能和活力都至关重要，甲硫氨酸缺乏可导致肿瘤微环境中肿瘤细胞和t细胞争夺甲硫氨酸，导致t细胞功能丧失和死亡，而给肿瘤病人补充甲硫氨酸可恢复t细胞活力，抑制肿瘤生长(bian et al.nature,2020)。甲硫氨酸添加可增加h3k79甲基化和ampk表达，从而降低cd4细胞上pd1表达，增强t细胞抗肿瘤免疫(pandit et al.nature commun,2023)。甲硫氨酸缺乏还可降低肿瘤细胞对化疗的敏感性(najim et al.anticancer res.2009)。甲硫氨酸缺乏饮食可降低小鼠结肠癌中t细胞丰度，导致肿瘤进展加快，饮食中添加甲硫氨酸可显著抑制结肠癌移植瘤生长，并与anti-pd1产生协同抗肿瘤作用(ji et al.natmetabolism,2023)。因此，甲硫氨酸到底是促进了肿瘤进展还是具有抗肿瘤作用尚存在争议，其背后的分子机制也不清楚。

28、因此，甲硫氨酸针对血清胆固醇的作用效果、针对肿瘤的治疗效果以及激活抗肿瘤免疫中的作用，目前尚不明确。现有技术中关于甲硫氨酸作用效果的报道多种多样，甲硫氨酸的作用效果可能是正向的，也可能是负向的。这些不一致的现有技术报道给进一步应用甲硫氨酸，造成了技术障碍。而在本技术方案中，通过高通量筛选，发现了甲硫氨酸类化合物在pcsk9基因表达调控上的作用，进一步明确了甲硫氨酸类化合物的作用机制，可以作为pcsk9抑制剂进一步应用。

29、现有技术目前尚无pcsk9的小分子抑制剂的报道。在基础科研方面，只能选择sirna,shrna,crispr/grna技术对pcsk9进行敲降或敲除，但这些方法均存在操作复杂，价格昂贵，重现性不佳等问题，开发其小分子抑制剂可极大的方便科研用途中的pcsk9抑制实验。在医疗用途方面，另外，鉴于pcsk9与高血脂症及相关代谢性疾病的相关性，以及其与癌症的相关性，开发其小分子抑制剂还有望为临床治疗提供潜在的新方式和药物。因此，本发明进一步针对pcsk9抑制剂进行了大规模的药物筛选，发现甲硫氨酸类化合物降低血清低密度脂蛋白胆固醇、抗肿瘤、激活肿瘤免疫中的应用临床用途。特别是针对癌症患者，可病理筛选出pcsk9高表达的实体肿瘤或血液肿瘤患者,使用本专利权利要求的药物为核心成分的制剂进行治疗。