一种治疗肺血栓的吸入式纳米马达及其制备方法和应用

本发明涉及药物制备方法，具体是一种治疗肺血栓的吸入式纳米马达及其制备方法和应用。

背景技术：

1、相比于治疗相对浅表的血栓，covid-19或其他原因引起肺血栓的治疗更具挑战性；

2、原因如下：(1)静脉注射的纳米药物血液循环周期短，靶向性差，难以在肺血栓中积累，导致生物利用度低，治疗效果受限。

3、(2)由于肺部位于生物体内组织深部，外部辅助装置难以通过胸腔到达肺并控制纳米载体的药物释放，如光热/光动力治疗响应型纳米药物治疗策略。

4、(3)超声设备无创、穿透深度强，被认为是最有前途的治疗手段之一，然而，由于肺组织中大量肺泡的特殊结构，超声响应型纳米给药系统很难在肺深部获得良好的响应。

5、(4)吸入式纳米药物可直接通过患者吸入后在肺部富集，可以在一定程度上解决静脉给药途径肺部药物富集不足的问题，然而，由于肺粘膜屏障的存在，传统的吸入纳米药物难以高效的穿过肺黏膜屏障到达肺部血栓部位，使治疗效果受到很大限制。

6、区别于上述治疗方式，微纳米马达因其能够实现药物的动态释放，已被用于治疗浅表性血栓，且具有良好的治疗效果，但目前所采用的微纳米马达通常需要配合激光或超声等辅助设备一同使用，以驱动纳米马达，达到药物释放的目的，然而，受近红外光和超声穿透深度的限制，难以用于深部肺组织的肺血栓治疗，常规响应型纳米马达需要使用生物酶或外界辅助设备才能触发纳米马达的运动和药物释放，此外，这些纳米马达的制备需要较严苛的反应条件，不利于工业化量产，针对上述问题，我们提出一种治疗肺血栓的吸入式纳米马达制备方法。

技术实现思路

1、为了解决目前常规马达受近红外光和超声穿透深度的限制，难以用于深部肺组织的肺血栓治疗的问题。

2、本发明提出一种治疗肺血栓的吸入式纳米马达制备方法，包括以下步骤；

3、步骤a，准备血小板膜和mnox备用；

4、步骤b，制备装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒；

5、步骤b1，将步骤a中准备的mnox分散在溶液中得到mnox溶液；

6、步骤b2，向mnox溶液中加入水蛭素和l-精氨酸并在冰浴条件下进行超声孵育，使水蛭素和l-精氨酸与mnox结合；

7、步骤b3，结合完成后进行离心，收集离心后的沉淀部分并进行洗涤，

8、洗涤后得到装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒备用；

9、步骤c，制备治疗肺血栓的吸入式纳米马达；

10、步骤c1，将步骤a中准备的血小板膜分散在溶液中；

11、步骤c2，将步骤b中制备的装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒分散在含血小板膜的溶液中并进行冰浴超声孵育，孵育过程中装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒与血小板膜结合，血小板膜包裹在装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒外表面；

12、步骤c3，孵育结束后，离心去除未结合的血小板膜并收集沉淀，将收集的沉淀物洗涤后得到治疗肺血栓的吸入式纳米马达。

13、优选的，还包括有步骤d，治疗肺血栓的吸入式纳米马达的检测；

14、具体步骤如下，

15、步骤d1，取100μg/ml治疗肺血栓的吸入式纳米马达置于含5％h2o的pbs溶液中；

16、步骤d2，转移至共聚焦培养皿中，利用相差显微镜观察记录治疗肺血栓的吸入式纳米马达的运动轨迹制成坐标图，获取粒子沿x轴方向的运动x；粒子沿y轴方向的运动y，以及时间间隔△t。

17、步骤d3，计算均方位移msd，计算公式的具体内容如公式1所示：msd＝(x(δt)-x(0))2+(y(δt)-y(0))2 1。

18、优选的，步骤a中，准备血小板膜的具体步骤如下，

19、步骤a1，取新鲜的balb/c小鼠全血，将全血稀释；

20、步骤a2，稀释后的全血进行第一次离心取得富血小板血浆；

21、步骤a3，对富血小板血浆进行第二次离心取得血小板；

22、步骤a4，洗涤血小板，并反复冻融洗涤后的血小板得到血小板膜；步骤a5，将血小板膜保存备用。

23、优选的，步骤a1中，稀释全血前，向全血中加入200μlacd即酸-柠檬酸盐-葡萄糖缓冲液，稀释过程中利用稀释液将小鼠全血稀释至3ml；

24、步骤a2中，在第一次离心前，将稀释后的小鼠全血倒入装有5ml分离液的试管内准备离心，第一次离心时，以200g离心15～30min；

25、步骤a3中，第二次离心时，以850g离心5～15min；

26、步骤a4中，第二次离心得到的血小板的洗涤次数不低于三次，冻融后得到的血小板膜保存温度控制在-80℃。

27、优选的，步骤a中，准备mnox的具体步骤如下，

28、步骤a6，用溶液溶解kmno4制取kmno4溶液；

29、步骤a7，向kmno4溶液中加入油酸后搅拌混合得到混合液；

30、步骤a8，对混合液进行离心获得mnox；

31、步骤a9，用洗涤液洗涤mnox后保存备用。

32、优选的，步骤a6中，溶液为去离子水，去离子水的量为500ml，溶解的kmno4的量为1.0g；

33、步骤a7中，加入的油酸量为10ml，搅拌时间为24h；

34、步骤a8中，离心的转速为8000r/s；

35、步骤a9中，洗涤液由乙醇和水组成，洗涤次数不少于三次，mnox保存温度控制在4℃。

36、优选的，步骤b1中，取用的mnox的量0.5g，溶液为去离子水，去离子水的量为10ml，分散的时间为10min；

37、步骤b2中，水蛭素的加入量为0.2-0.8g，l-精氨酸的加入量为0.5-1.5g冰浴中超声的时间为2h，超声功率为300w；

38、步骤b3中，离心的转速为8000r/s，洗涤液为去离子水，洗涤次数不少于三次。

39、优选的，步骤c1中，溶液为去离子水；

40、步骤c1和步骤c2中，装载水蛭素和l-精氨酸的纳米颗粒与血小板膜的加入比例为1∶5；

41、步骤c3，洗涤液为去离子水，洗涤次数不少于三次。

42、一种治疗肺血栓的吸入式纳米马达的应用，在制备或研发治疗肺血栓的吸入式纳米马达上的应用。

43、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

44、1、本发明中，血小板膜的包封使得纳米马达具有良好的生物相容性，可以靶向血栓，可以穿过肺粘膜屏障增强药物滞留；

45、(2)mnox催化h202，生成02，不仅为纳米马达提供移动的动力，而且h202的消耗减轻了炎症和肺缺氧，调节巨噬细胞向抗炎表型极化，l-精氨酸作为氮源，在h202和一氧化氮合酶的催化下产生no，扩张血管，阻止血小板活化；

46、(3)释放的水蛭素直接与凝血酶结合防止凝血和血栓的复发；

47、(4)该纳米马达具有成本低、合成灵活、晶体结构多样、价态多样以及催化活性高的优点适合产业化生产。