IL-23AmRNA、DMP-Lac纳米粒/IL-23AmRNA复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途

本发明属于生物医药，具体涉及一种il-23a mrna、dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术：

1、癌症是仅次于心血管疾病的全球第二大死亡原因。根据国际癌症研究机构(iarc)发布的统计数据，2020年全球癌症负担已上升至1930万例，死亡例数达到1000万例。其中结直肠癌已成为癌症中第二大常见死亡原因，其在年轻人中的发病率正在上升，目前常见的治疗方法有化疗和手术切除等。

2、近年来肿瘤免疫治疗和基因治疗应运而生，成为抗肿瘤治疗领域的研究热点。肿瘤免疫治疗通过激活免疫系统来治疗肿瘤，肿瘤基因疗法则通过取代有缺陷的基因或增加新基因来达到治愈疾病或提高抵抗疾病能力的目的。肿瘤免疫基因疗法将两者联合使用，具有协同作用并且更具选择性和有效性，并可能产生长期的保护作用。

3、白介素和相关细胞因子是先天性和适应性免疫细胞以及非免疫细胞和组织的通讯手段。il23属于il-12细胞因子家族，在炎症反应，尤其是th17细胞诱导的自身免疫疾病中发挥重要作用。il23是一个异源二聚体的细胞因子，由il23a p19和il12b p40两个亚基组成。il23一般由活化的巨噬细胞或者树状细胞产生，并作用于表达il23受体的th17细胞，促进其增殖。它具有多种生物学功能，能促进t细胞尤其是cd4t细胞增殖，促进t细胞、抗原提呈细胞产生ifn-γ与il-12，对树突状细胞的共刺激功能起调节作用，在肿瘤免疫中发挥的重要作用，具有抗肿瘤和抗转移活性。但目前的研究中，仅证明il-23a蛋白质具有抗肿瘤活性，并无直接应用il23a mrna治疗肿瘤的研究，因此关于il-23a的mrna是否能应用于抗肿瘤领域，还需要进一步的研究。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题为：现有缺乏il-23a mrna是否具有抗肿瘤效果、如何进行递送、如何抗肿瘤等研究的问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种il-23a mrna在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

3、其中，上述用途中，所述的il-23a mrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。

4、seq id no:1il-23a mrna的核苷酸序列

5、atgctggattgcagagcagtaataatgctatggctgttgccctgggtcactcagggcctggctgtgcctaggagtagcagtcctgactgggctcagtgccagcagctctctcggaatctctgcatgctagcctggaacgcacatgcaccagcgggacatatgaatctactaagagaagaagaggatgaagagactaaaaataatgtgccccgtatccagtgtgaagatggttgtgacccacaaggactcaaggacaacagccagttctgcttgcaaaggatccgccaaggtctggctttttataagcacctgcttgactctgacatcttcaaaggggagcctgctctactccctgatagccccatggagcaacttcacacctccctactaggactcagccaactcctccagccagaggatcacccccgggagacccaacagatgcccagcctgagttctagtcagcagtggcagcgcccccttctccgttccaagatccttcgaagcctccaggcctttttggccatagctgcccgggtctttgcccacggagcagcaactctgactgagcccttagtgccaacagct。

6、其中，上述用途中，所述il-23a mrna的使用方法为与dmp-lac纳米粒结合，形成dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物。所述dmp-lac纳米粒的平均粒径为249.50±21.37nm，平均电位为+17.40±1.87mv。

7、其中，上述用途中，所述的dmp-lac纳米粒由dotap阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mpeg-pcl混合罗伊氏乳杆菌裂解物制备得到。

8、其中，上述用途中，所述的dmp-lac纳米粒的具体组成为：dotap重量份数为1～5份，两亲性mpeg-pcl双嵌段共聚物的重量份数为45～50份，罗伊氏乳杆菌裂解物的重量份数为10～15份。

9、其中，上述用途中，所述的肿瘤为结直肠癌。

10、本发明还提供了一种dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物，由dotap阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mpeg-pcl包裹肿瘤细胞裂解物制备的dmp-lac纳米粒，与il-23amrna分子静电吸附获得。

11、其中，所述的dmp-lac纳米粒的重量份数为30～40份，il-23a mrna为1～5份。

12、本发明还提供了一种上述dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物的制备方法，包括以下步骤：

13、a、将罗伊氏乳杆菌菌种液重悬，在厌氧摇床上孵育过夜获得细菌悬液，采用高压破壁机破壁处理30～60min，采用细胞超声破碎仪超声30～60min，过滤，得到细菌裂解液；

14、b、称取原料，mpeg-pcl共聚物45～50份、dotap 1～5份；

15、c、将mpeg-pcl共聚物、dotap共同溶于溶剂中，然后采用旋转蒸发仪，在50～65℃水浴条件下运行35～45min从而将溶剂蒸发，随后加10～15份细菌裂解液水化；直到完全溶解，得到dmp-lac纳米粒溶液；

16、d、取dmp-lac纳米粒30～40份，il-23a mrna 1～5份，在室温下混合孵育5～15分钟，得到dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物。

17、其中，上述dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物的制备方法中，步骤a所述重悬采用mrs肉汤培养基；所述破壁处理的压力值为400～600bar；所述厌氧摇床的温度为37℃；所述超声破碎仪超声时间设置为5～10秒，超声间隙设置为5～10秒；所述过滤采用0.22μm的滤膜。

18、其中，上述dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物的制备方法中，步骤c所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或环己烷中的至少一种；所述的有机相溶剂为乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、甲醇中的至少一种。

19、本发明所述il-23a mrna分子可以由以下体外转录法制备得到，包括以下步骤：

20、a、合成mrna转录模板，通过聚合酶链式反应(pcr)从质粒载体扩增小鼠il-23a基因编码序列。其中，正向引物序列如seq id no:2所示，反向引物序列如seq id no:3所示。将产物进行凝胶电泳后胶回收，得到il-23a mrna转录模板。

21、b、使用mmessage-mmachine t7转录试剂盒，用体外转录的方法从转录模板制备il-23a mrna。再使用mmessage-mmachine t7纯化试剂盒，将上述方法中得到的il-23amrna进行进一步纯化操作。

22、seq id no:2正向引物序列

23、5'-taatacgactcactatagggatgctggattgcagagcagt-3'。

24、seq id no:3反向引物序列

25、5'-agctgttggcactaagggct-3'。

26、本发明还提供了一种上述dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

27、进一步的，所述的肿瘤为结直肠癌。

28、本发明的有益效果为：

29、本发明首次发现il-23a mrna可以用于制备预防或治疗肿瘤的药物，并首次对il-23amrna的应用开发出了新的方式，即通过与dmp-lac纳米粒结合，形成dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物的方式进行递送。本发明首次针对il-23a mrna开发出了递送效率高的dmp-lac纳米粒，两者形成的复合物可以有效地将目的基因导入细胞中，在基于il-23amrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。本发明的dmp-lac纳米粒可介导基因发挥疗效，dmp-lac纳米粒递送的il-23a基因的mrna分子可以在体内有效抑制结肠癌肿瘤组织的生长。dmp-lac纳米粒是一种相对安全且高效的mrna分子非病毒基因递送载体，制备所得dmp-lac纳米粒/il-23a mrna复合物为疾病治疗提供了一种新的策略。